Сравнительная характеристика конститутивной и индуцибельной систем экспрессии белка L1 вируса папилломы человека 18 типа в Kluyveromyces lactis

Обоснование. Использование профилактических вакцин против ВПЧ показало эффективность в снижении заболеваемости раком шейки матки. Дрожжи Kluyveromyces lactis являются перспективной платформой для получения рекомбинантных вакцинных антигенов благодаря статусу GRAS, наличию эукариотической системы посттрансляционных модификаций и низкой стоимости питательных сред.

Цель исследования. Разработка штамма-продуцента на основе Kluyveromyces lactis для получения рекомбинантного белка L1 вируса папилломы человека 18 типа.

Материалы и методы. Для экспрессии гена L1 ВПЧ 18 типа сконструированы два интеграционных вектора. Первый – pPOG-HPV18 с конститутивным промотором GAP, второй – pKB-HPV18 с индуцибельным промотором LAC4. Полученными векторами трансформировали клетки K. lactis методом электропорации. Культивирование рекомбинантных штаммов проводили на среде YEPm. Индукцию синтеза белка для штамма K. lactis / pKB-HPV18 проводили с помощью лактозы. Целевой белок из клеточных лизатов выделяли методом ионообменной хроматографии (SP Seplife). Идентификацию белка проводили с помощью хромато-масс-спектрометрии. Эксперименты выполнены в трех биологических повторностях. Статистическую значимость различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (p < 0,05).

Результаты. Получены штаммы-продуценты для обеих конструкций. Выход биомассы для K. lactis / pPOG-HPV18 составил 20 г/л, для K. lactis / pKB-HPV18 – 34 г/л. Степень чистоты целевого белка после одной стадии очистки достигла 70–80 % для конститутивной системы и приблизилась к 90 % для индуцибельной системы. Методом хромато-масс-спектрометрии подтверждена идентичность и структурная целостность полученного белка.

Заключение. Сконструированы два штамма-продуцента K. lactis, обеспечивающие синтез белка L1 ВПЧ 18 типа. Система с индуцибельным промотором LAC4 показала более высокий выход биомассы и степень чистоты целевого белка по сравнению с конститутивной системой. Полученные результаты создают основу для дальнейшей разработки доступной системы продукции вакцинного антигена ВПЧ 18 типа.

1. Liu F, Xu J, Yang R, Liu S, Hu S, Yan M, et al. New light on treatment of cervical cancer: Chinese medicine monomers can be effective for cervical cancer by inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway. Biomedicine and Pharmacotherapy. 2023; 157: 114084. doi: 10.1016/j.biopha.2022.114084

2. Wu J, Jin Q, Zhang Y, Ji Y, Li J, Liu X, et al. Global burden of cervical cancer: current estimates, temporal trend and future projections based on the GLOBOCAN 2022. Journal of the National Cancer Center. 2025; 5(3): 322–329. doi: 10.1016/j.jncc.2024.11.006

3. Афанасьев М.С., Душкин А.Д., Афанасьев С.С., Несвижский Ю.В., Гришачева Т.Г., Бирюкова Е.С. и др. Типовое разнообразие папилломавирусов человека высокого канцерогенного риска при клинических формах инфекции шейки матки в Российской Федерации. Инфекция и иммунитет. 2025; 15(2): 271–286. doi: 10.15789/2220-7619-tpo17690

4. Cascardi E, Cazzato G, Daniele A, Silvestris E, Cormio G, Di Vagno G, et al. Association between cervical microbiota and HPV: could this be the key to complete cervical cancer eradication? Biology. 2022;11(8): 1114. doi: 10.3390/biology11081114

5. Zhou D, Xue J, Sun Y, Zhu L, Zhao M, Cui M, et al. Patterns of single and multiple HPV infections in female: A systematic review and meta-analysis. Heliyon. 2024; 10(17): e35736. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e35736

6. Wang R, Huang H, Yu C, Li X, Wang Y, Xie L. Current status and future directions for the development of human papillomavirus vaccines. Frontiers in Immunology. 2024; 15: 1362770. doi: 10.3389/fimmu.2024.1362770

7. Palatty PL, Sacheendran D, Jayachandran M. Human Papilloma Virus Vaccines. In: Baloh Z (ed.). Confronting HPV: Insights and Solutions. Books on Demand; 2025: 77–78. doi: 10.5772/intechopen.1004419

8. Brotherton JML, LaMontagne DS, Bloem PJN. Global status of HPV vaccination two decades in: effective, safe and preventing cancer. Expert Rev Vaccines. 2026; 25(1): 2609869. doi: 10.1080/14760584.2025.2609869

9. Shivakumar T, Das A, Bussoletti Panizo MV, Storch M, Thavarajah W, Freemont PS, et al. A Lactose-Based Kluyveromyces lactis Cell-Free Protein Synthesis System. Chem Bio Eng. 2025; 2(10): 602–611. doi: 10.1021/cbe.5c00011

10. Spohner SC, Schaum V, Quitmann H, Czermak P. Kluyveromyces lactis: an emerging tool in biotechnology. Journal of Biotechnology. 2016; 222: 104–116. doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.02.023

11. Ohstrom AM, Buck AE, Du X, Wee J. Evaluation of Kluyveromyces spp. for conversion of lactose in different types of whey from dairy processing waste into ethanol. Frontiers in Microbiology. 2023; 14: 1208284. doi: 10.3389/fmicb.2023.1208284

12. Liao L, Shen X, Li J, Du G, Chen J, Zhang G. A dual strategy of metabolic engineering and multisite integration for enhanced lactase production in Kluyveromyces lactis. Chemical Engineering Journal. 2026; 531: 174271. doi: 10.1016/j.cej.2026.174271

13. Eng JK, Jahan TA, Hoopmann MR. Comet: an open source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. 2013; 13(1): 22–24. doi: 10.1002/pmic.201200439

14. Mattanovich D, Branduardi P, Dato L, Gasser B, Sauer M, Porro D. Recombinant protein production in yeasts. Methods in Molecular Biology. 2012; 824: 329–358. doi: 10.1007/978-1-61779-433-9_17

15. Porro D, Gasser B, Fossati T, Maurer M, Branduardi P, Sauer M, et al. Production of recombinant proteins in yeasts: when are these systems better than bacterial production systems? Applied Microbiology and Biotechnology. 2011; 89(4): 939–948. doi: 10.1007/s00253-010-3019-z

16. Chen YM, Liu YuCh, Zhang GP, et al. Human papillomavirus L1 protein expressed in Escherichia coli self-assembles into virus-like particles that are highly immunogenic. Virus research. 2016; 220: 97–103. doi: 10.1016/j.virusres.2016.04.017

17. Rosmeita CN, Budiarti S, Mustopa AZ, et al. Expression, purification, and characterization of self-assembly virus-like particles of capsid protein L1 HPV 52 in Pichia pastoris GS115. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2023; 21(1): 126. doi: 10.1186/s43141-023-00571-0

18. Gashti AB, Patel M, Chahal PS, et al. Purification and functional characterization of gag-spike virus-like particles: Process optimization for efficient vaccine production. Vaccine. 2025; 62: 127500. doi: 10.1016/j.vaccine.2025.127500

19. Jensen ON. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Current opinion in chemical biology. 2004; 8(1): 33–41. doi: 10.1016/j.cbpa.2003.12.009

20. Sampaio FC, et al. Cheese whey permeate fermentation by Kluyveromyces lactis: a combined approach to wastewater treatment and bioethanol production. Environmental technology. 2020; 41(24): 3210–3218. doi: 10.1080/09593330.2019.1604813