Рар Анастасия Анатольевна – инженер-микробиолог отдела разработки технологий и пилотного производства биопрепаратов
630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область
Anastasiya A. Rar – microbiologist engineer of the Department of Technology Development and Pilot Production
Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559
Волосникова Екатерина Александровна – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела разработки технологий и пилотного производства биопрепаратов
630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область
Ekaterina A. Volosnikova – Cand. Sc. (Biol.), lead research fellow of the Department of Technology Development and Pilot Production of biological products
Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559
Беленькая Светлана Валерьевна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела биофизики и экологических исследований
630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область
Svetlana V. Belenkaya – Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow of the Department of Biophysics and Environmental Research
Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559
Гогина Яна Станиславовна – старший научный сотрудник отдела разработки технологий и пилотного производства биопрепаратов
630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область
Yana S. Gogina – senior research fellow of the Department of Technology Development and Pilot Production of Biological Products
Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559
Щербаков Дмитрий Николаевич – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела биофизики и экологических исследований
630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область
Dmitry N. Shcherbakov – Cand. Sc. (Biol.), lead research fellow of the Department of Biophysics and Environmental Research
Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559
Обоснование. Использование профилактических вакцин против ВПЧ показало эффективность в снижении заболеваемости раком шейки матки. Дрожжи Kluyveromyces lactis являются перспективной платформой для получения рекомбинантных вакцинных антигенов благодаря статусу GRAS, наличию эукариотической системы посттрансляционных модификаций и низкой стоимости питательных сред.
Цель исследования. Разработка штамма-продуцента на основе Kluyveromyces lactis для получения рекомбинантного белка L1 вируса папилломы человека 18 типа.
Материалы и методы. Для экспрессии гена L1 ВПЧ 18 типа сконструированы два интеграционных вектора. Первый – pPOG-HPV18 с конститутивным промотором GAP, второй – pKB-HPV18 с индуцибельным промотором LAC4. Полученными векторами трансформировали клетки K. lactis методом электропорации. Культивирование рекомбинантных штаммов проводили на среде YEPm. Индукцию синтеза белка для штамма K. lactis / pKB-HPV18 проводили с помощью лактозы. Целевой белок из клеточных лизатов выделяли методом ионообменной хроматографии (SP Seplife). Идентификацию белка проводили с помощью хромато-масс-спектрометрии. Эксперименты выполнены в трех биологических повторностях. Статистическую значимость различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (p < 0,05).
Результаты. Получены штаммы-продуценты для обеих конструкций. Выход биомассы для K. lactis / pPOG-HPV18 составил 20 г/л, для K. lactis / pKB-HPV18 – 34 г/л. Степень чистоты целевого белка после одной стадии очистки достигла 70–80 % для конститутивной системы и приблизилась к 90 % для индуцибельной системы. Методом хромато-масс-спектрометрии подтверждена идентичность и структурная целостность полученного белка.
Заключение. Сконструированы два штамма-продуцента K. lactis, обеспечивающие синтез белка L1 ВПЧ 18 типа. Система с индуцибельным промотором LAC4 показала более высокий выход биомассы и степень чистоты целевого белка по сравнению с конститутивной системой. Полученные результаты создают основу для дальнейшей разработки доступной системы продукции вакцинного антигена ВПЧ 18 типа.
Background. The use of prophylactic HPV vaccines has demonstrated effectiveness in reducing the incidence of cervical cancer. The yeast Kluyveromyces lactis is a promising platform to produce recombinant vaccine antigens, owing to its GRAS status, eukaryotic post translational modification capabilities, and the low cost nutrient media.
Aim. To develop a producer strain based on Kluyveromyces lactis for the production of recombinant human papillomavirus type 18 L1 protein.
Materials and Methods. For the expression of the HPV18 L1 gene, two integrative vectors were constructed. The first, pKB-HPV18, with a constitutive GAP promoter, and the second, pKB-HPV18, with an inducible LAC4 promoter. K. lactis cells were transformed with the obtained vectors by electroporation. Recombinant strains were cultivated in YEPm medium. Protein synthesis induction for the K. lactis/pKB-HPV18 strain was performed using lactose. The target protein was isolated from cell lysates by ion exchange chromatography (SP Seplife). Protein identification was carried out using liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC MS/MS). All experiments were performed in three biological replicates. Statistical significance was assessed using Student’s t-test (p < 0.05).
Results. Producer strains were obtained for both constructs. The biomass yield was 20 g/L for K. lactis/pKB-HPV18 and 34 g/L for K. lactis/pKB-HPV18. The purity of the target protein after a single ion-exchange chromatography step reached 70–80% for the constitutive system and approached 90% for the inducible system. The identity and structural integrity of the obtained protein were confirmed using LC MS/MS.
Conclusion. Two K. lactis producer strains capable of synthesizing HPV18 L1 protein were successfully constructed. The system with the inducible LAC4 promoter showed higher biomass yield and target protein purity compared to the constitutive system. These results provide a foundation for the further development of an affordable production system for the HPV18 vaccine antigen.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.