Исследование стабильности штамма-продуцента анальгетического пептида HCRG21

Разработка новых, более эффективных обезболивающих препаратов, обладающих высоким сродством к биологическим мишеням, является актуальной задачей. Кандидатом для разработки нового анальгетического препарата стал пептид HCRG21 морской анемоны Heteractis magnifica – блокатор TRPV1-канала.

Цель исследования. Провести исследование генетической и экспрессионной стабильности штамма Escherichia coli Origami2(К12)/pLysS/рSMT3_HCRG21, продуцирующего гибридный белок SMT3_HCRG21.

Материалы и методы. Жизнеспособность клеток рабочей посевной культуры (РПК) при последовательных пассажах оценивали путем расчета титра клеток в каждом пассаже. Количество генераций РПК определяли на основании значений титра жизнеспособных клеток для каждого пассажа по соответствующей формуле. Уровень экспрессии гибридного белка в последовательных пассажах клеток был рассчитан посредством отношения количества гибридного белка к общему белку клеточного лизата. Содержание белка определяли по методу Лоури и с помощью электрофореза. Методами ПЦР и электрофоретического разделения определяли размер участка ДНК, кодирующего гибридный белок SMT3_HCRG21, а также проводили секвенирование по Сэнгеру для подтверждения подлинности вставки.

Результаты. Показано, что при последовательных пересевах титр клеток варьирует от 8,3·10⁷ до 1,7·10⁹ клеток/мл, а среднее число генераций составило 10,4 ± 2,3. В результате амплификации пДНК клонов 10, 90 и 140 генераций были получены фрагменты длиной около 600 н.п., что соответствует длине нуклеотидной последовательности генетической конструкции pSMT3_HCRG21 (541 н.п.). Нуклеотидные последовательности полученных ПЦР-фрагментов оказались полностью идентичны заявленным в паспорте штамма-продуцента. Продемонстрировано, что среднее содержание гибридного белка между генерациями сохранялось на уровне 16 %, что свидетельствует о высокой стабильности уровня продуктивности штамма.

Заключение. Биосинтетическая активность и количество жизнеспособных клеток штамма E. coli Origami2(К12)/pLysS/рSMT3_HCRG21 остаются стабильными, таким образом, штамм может быть использован для производства анальгетического пептида HCRG21.

1. Cazacu I, Mogosan C, Loghin F. Safety issues of current analgesics: an update. Clujul Med. 2015; 88: 128–36. doi: 10.15386/cjmed-413

2. Monastyrnaya M, Peigneur S, Zelepuga E, Sintsova O, Gladkikh I, Leychenko E, et al. Kunitz-Type Peptide HCRG21 from the Sea Anemone Heteractis crispa Is a Full Antagonist of the TRPV1 Receptor. Mar Drugs. 2016; 14(12): 229. doi: 10.3390/md14120229

3. Kvetkina AN, Leychenko EV, Yurchenko EA, Pislyagin EA, Peigneur S, Tytgat Y, et al. A New Iq-Peptide of the Kunitz Type from the Heteractis magnifica Sea Anemone Exhibits Neuroprotective Activity in a Model of Alzheimer’s Disease. Russ J Bioorg Chem. 2018; 44: 416–23. doi: 10.1134/S106816201804012X

4. Mishra M. Evolutionary Aspects of the Structural Convergence and Functional Diversification of Kunitz-Domain Inhibitors. Journal of Molecular Evolution. 2020; 88: 537–548. doi: 10.1007/s00239-020-09959-9

5. Carnevale V, Rohacs T. TRPV1: A Target for Rational Drug Design. Pharmaceuticals (Basel). 2016; 9(3): 52. doi: 10.3390/ph9030052

6. Maximiano TKE, Carneiro JA, Fattori V, Verri WA. TRPV1: Receptor structure, activation, modulation and role in neuro-immune interactions and pain. Cell Calcium. 2024; 119: 102870. doi: 10.1016/j.ceca.2024.102870

7. Синцова О.В., Паликов В.А., Паликова Ю.А., Климович А.А., Гладких И.Н., Андреев Я.А., и др. Пептидный блокатор ионного канала TRPV1 проявляет длительный анальгетический эффект в модели тепловой стимуляции. Доклады Российской Академии Наук, Науки о Жизни. 2020; 493: 423–426. doi: 10.31857/s268673892003018x

8. Патент РФ № 2755206 C1, 2020 Средство пролонгированного анальгетического действия и лекарственный препарат на его основе / Лейченко Е.В., Синцова О.В., Гладких И.Н., Климович А.А., Монастырная М.М., Дьяченко И.А., и др. Заявитель и патентообладатель Федеральное гос. бюджетное учреждение науки Тихоокеан. институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН–№ 2020117918/04; заявл. 20.05.2020; опубл. 14.09.2021, Бюл. № 26 – 24с. 2021.

9. Sintsova O, Gladkikh I, Klimovich A, Palikova Y, Palikov V, Styshova O, et al. TRPV1 Blocker HCRG21 Suppresses TNF-α Production and Prevents the Development of Edema and Hypersensitivity in Carrageenan-Induced Acute Local Inflammation. Biomedicines. 2021; 9(7): 716. doi: 10.3390/biomedicines9070716

10. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951; 193:265–275.

11. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680–685. doi: 10.1038/227680a0

12. Патент РФ № 2798545 C1, 2022 Рекомбинантная плазмидная ДНК pSMT3_HCRG21, кодирующая гибридный белок SMT3-HCRG21, штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pSMT3_HCRG21 – продуцент анальгетического пептида HCRG21 и способ получения рекомбинантного анальгетического пептида HCRG21 / Терешин М.Н., Степаненко В.Н., Лейченко Е.В., Козловская Э.П., Подволоцкая А.Б., Текутьева Л.А., и др. Заявитель и патентообладатель Федеральное гос. бюджетное учреждение науки Тихоокеан. институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, ООО «АРНИКА»–№ 2022125725; заявл. 03.10.2022; опубл. 23.06.2023 Бюл. № 18 – 13с. 2023.

13. Tereshin MN, Komyakova AM, Stepanenko VN, Myagkikh IV, Shoshina NS, Korolkova YV, et al. Optimized method for the recombinant production of a sea anemone’s peptide. Mendeleev Communications. 2022; 32: 745– 746. doi: 10.1016/j.mencom.2022.11.012