Павленко Александра Павловна – младший научный сотрудник департамента комплексных проектов, Передовая инженерная школа «Институт биотехнологий, биоинженерии и пищевых систем», ФГАОУ ВО «Дальневосточный федеральный университет»; младший научный сотрудник лаборатории молекулярной фармакологии и биомедицины, Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН
690922, г. Владивосток, о. Русский, п. Аякс, д. 10,
690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостоку, 159
Aleksandra P. Pavlenko – junior researcher at the Department of Complex Projects, Advanced Engineering School «Institute of Biotechnology, Bioengineering and Food Systems», Far Eastern Federal University; junior researcher at the Laboratory of Molecular Pharmacology and Biomedicine, G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences
10 Ajax Bay, Russky Island, Vladivostok 690922,
100-letiya Vladivostoka Prospekt, 159, Vladivostok 690022
Кветкина Александра Николаевна – кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной фармакологии и биомедицины
690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостоку, 159
Aleksandra N. Kvetkina – Cand. Sc. (Chem.), researcher at the Laboratory of Molecular Pharmacology and Biomedicine
100-letiya Vladivostoka Prospekt, 159, Vladivostok 690022
Балдаев Сергей Николаевич – младший научный сотрудник лаборатории морской биохимии
690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостоку, 159
Sergey N. Baldaev – junior researcher at the Laboratory of Marine Biochemistry
100-letiya Vladivostoka Prospekt, 159, Vladivostok 690022
Лейченко Елена Владимировна – кандидат химических наук, доцент, старший научный сотрудник Департамента комплексных проектов, Передовая инженерная школа «Институт биотехнологий, биоинженерии и пищевых систем», ФГАОУ ВО «Дальневосточный федеральный университет»; заведующий лабораторией молекулярной фармакологии и биомедицины, Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН
690922, г. Владивосток, о. Русский, п. Аякс, д. 10,
690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостоку, 159
Elena V. Leychenko – Cand. Sc. (Chem.), Associate Professor, senior researcher at the Department of Complex Projects, Advanced Engineering School «Institute of Biotechnology, Bioengineering and Food Systems», Far Eastern Federal University; The Head of the Laboratory of Molecular Pharmacology and Biomedicine, G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences
10 Ajax Bay, Russky Island, Vladivostok 690922,
100-letiya Vladivostoka Prospekt, 159, Vladivostok 690022
Разработка новых, более эффективных обезболивающих препаратов, обладающих высоким сродством к биологическим мишеням, является актуальной задачей. Кандидатом для разработки нового анальгетического препарата стал пептид HCRG21 морской анемоны Heteractis magnifica – блокатор TRPV1-канала.
Цель исследования. Провести исследование генетической и экспрессионной стабильности штамма Escherichia coli Origami2(К12)/pLysS/рSMT3_HCRG21, продуцирующего гибридный белок SMT3_HCRG21.
Материалы и методы. Жизнеспособность клеток рабочей посевной культуры (РПК) при последовательных пассажах оценивали путем расчета титра клеток в каждом пассаже. Количество генераций РПК определяли на основании значений титра жизнеспособных клеток для каждого пассажа по соответствующей формуле. Уровень экспрессии гибридного белка в последовательных пассажах клеток был рассчитан посредством отношения количества гибридного белка к общему белку клеточного лизата. Содержание белка определяли по методу Лоури и с помощью электрофореза. Методами ПЦР и электрофоретического разделения определяли размер участка ДНК, кодирующего гибридный белок SMT3_HCRG21, а также проводили секвенирование по Сэнгеру для подтверждения подлинности вставки.
Результаты. Показано, что при последовательных пересевах титр клеток варьирует от 8,3·107 до 1,7·109 клеток/мл, а среднее число генераций составило 10,4 ± 2,3. В результате амплификации пДНК клонов 10, 90 и 140 генераций были получены фрагменты длиной около 600 н.п., что соответствует длине нуклеотидной последовательности генетической конструкции pSMT3_HCRG21 (541 н.п.). Нуклеотидные последовательности полученных ПЦР-фрагментов оказались полностью идентичны заявленным в паспорте штамма-продуцента. Продемонстрировано, что среднее содержание гибридного белка между генерациями сохранялось на уровне 16 %, что свидетельствует о высокой стабильности уровня продуктивности штамма.
Заключение. Биосинтетическая активность и количество жизнеспособных клеток штамма E. coli Origami2(К12)/pLysS/рSMT3_HCRG21 остаются стабильными, таким образом, штамм может быть использован для производства анальгетического пептида HCRG21.
The development of new, more effective analgesic drugs with high affinity for biological targets is a critical challenge. The peptide HCRG21, a TRPV1 channel blocker derived from the sea anemone Heteractis magnifica, is considered as a promising candidate for a new analgesic drug.
Aim. To investigate the genetic and expression stability of the Escherichia coli strain Origami2(K12)/pLysS/pSMT3_HCRG21, which produces the SMT3_HCRG21 fusion protein.
Materials and methods. The viability of the working seed lot (WSL) during sequential passaging was assessed by calculating the cell titer in each passage. The number of generations of WSL cells was determined based on the viable cell titer values for each passage using an appropriate equation. The expression level of the fusion protein during continuous cell passaging was calculated as the ratio of the fusion protein amount to the total cellular protein in the cell lysate. Protein content was determined using the Lowry method and electrophoresis. The size of the DNA region encoding the SMT3_HCRG21 fusion protein was determined by PCR and electrophoretic separation, and Sanger sequencing was performed to confirm its genetic identity as specified in the strain passport.
Results. During continuous passaging, the cell titer has been shown to vary from 8.3·107 to 1.7·109 cells/mL, and the average number of generations was 10.4 ± 2.3. Following pDNA amplification of clones from 10, 90, and 140 generations the PCR fragments of approximately 600 bp in length were obtained, which correspond to the length of the nucleotide sequence of the pSMT3_HCRG21 genetic construct (541 bp). The nucleotide sequences of the obtained PCR fragments were identical to those specified in the strain passport. It was demonstrated that the average content of the fusion protein across generations remained at 16 %, indicating a high stability of the strain productivity level.
Conclusions. The biosynthetic activity and viable cell titer of the E. coli strain Origami2(K12)/pLysS/pSMT3_HCRG21 remained stable; therefore, the strain can be used for industrial production of the analgesic peptide HCRG21.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.