Количественное определение фоновой экспрессии интерферона бета в культуре клеток сибирской ночницы (Myotis sibiricus)

Обоснование. Рукокрылые являются хозяевами и переносчиками широкого спектра зоонозов. Исследование иммунного ответа этих млекопитающих на вирусные инфекции необходимо для раскрытия фундаментальных механизмов циркуляции зоонозных инфекций в природе. Существует гипотеза о постоянно «включенной» активности белков интерферонового пути у рукокрылых для противодействия вирусным инфекциям. В этом исследовании мы оценили уровень активности системы врожденного иммунитета в клеточной линии почки сибирской ночницы (Myotis sibiricus, Kastschenko, 1905) MdbK3-14, взяв в качестве маркера экспрессию интерферона бета.

Цель исследования. Оценить фоновый уровень экспрессии гена интерферона бета (IFN-β) в неинфицированных клетках Myotis sibiricus.

Методы. Культуру клеток MdbK3-14 выращивали в 24-луночных планшетах. Монослои клеток открепляли раствором трипсина и выделяли суммарную РНК. Концентрацию мРНК транскриптов гена IFN-β и референтных генов бета-актина (ACTB) и субъединицы A сукцинатдегидрогеназного комплекса (SDHA) определяли с помощью одностадийной мультиплексной ОТ-рвПЦР и подтверждали с помощью ОТ-цПЦР.

Результаты. Разработаны специфичные праймеры с зондом для детекции мРНК гена IFN-β в клетках рукокрылых. Выявлена стабильная детекция транскриптов генов SDHA и IFN-β как в ОТ-рвПЦР (CV = 0,5 % и CV = 0,2 % соответственно), так и в ОТ-цПЦР (CV = 0,8 % и CV = 1,4 % соответственно). Детекция мРНК ACTB в ОТ-цПЦР также проходила равномерно во всех образцах (CV = 0,8  %), однако в ОТ-рвПЦР выявлена некоторая нестабильность для бета-актина (CV = 3,6 %). Результаты количественного определения в ОТ-рвПЦР и ОТ-цПЦР коррелировали между собой. Установлено, что уровень экспрессии IFN-β в клетках MdbK3-14 сопоставим (в ОТ-рвПЦР в среднем 0,97 ± 0,15 отн.ед.) или несколько ниже (в ОТ-цПЦР в среднем 0,13 ± 0,05 отн.ед.), чем экспрессия белков домашнего хозяйства ACTB и SDHA.

Заключение. При отсутствии иммунной стимуляции в клетках почки M. sibiricus наблюдается фоновая экспрессия IFN-β.

1. Ботвинкин А.Д. Вирусы и летучие мыши: междисциплинарные проблемы. Вопросы вирусологии. 2021; 66(4): 259-268. doi: 10.36233/0507-4088-79

2. Baker ML, Schountz T, Wang LF. Antiviral immune responses of bats: a review. Zoonoses Public Health. 2013; 60(1): 104-16. doi: 10.1111/j.1863-2378.2012.01528.x

3. Liang YZ, Wu LJ, Zhang Q, et al. Cloning, expression, and antiviral activity of interferon β from the Chinese microbat, Myotis davidii. Virol Sin. 2015; 30(6): 425-32. doi: 10.1007/s12250-015-3668-2

4. Li J, Zhang G, Cheng D, Ren H, et al. Molecular characterization of RIG-I, STAT-1 and IFN-beta in the horseshoe bat. Gene. 2015; 561(1): 115-23. doi: 10.1016/j.gene.2015.02.013

5. Hölzer M, Schoen A, Wulle J, et al. Virus- and Interferon Alpha-Induced Transcriptomes of Cells from the Microbat Myotis daubentonii. iScience. 2019; 19: 647-661. doi: 10.1016/j.isci.2019.08.016

6. Schountz T, Baker ML, Butler J, Munster V. Immunological Control of Viral Infections in Bats and the Emergence of Viruses Highly Pathogenic to Humans. Front Immunol. 2017; 8: 1098. doi: 10.3389/fimmu.2017.01098

7. Zhou P, Tachedjian M, Wynne JW, et al. Contraction of the type I IFN locus and unusual constitutive expression of IFN-α in bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2016; 113(10): 2696- 701. doi: 10.1073/pnas.1518240113

8. Ляпунова Н.А., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А. Оптимизация методики количественной ОТ-ПЦР для оценки концентрации геномной +РНК вируса клещевого энцефалита. Acta biomedica scientifica. 2019; 4(5): 116-121. doi: 10.29413/ABS.2019-4.5.18

9. Ляпунова Н.А., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А. Особенности репродукции вируса клещевого энцефалита в новой перевиваемой линии клеток сибирской ночницы Myotis sibiricus (Kastschenko, 1905). Acta biomedica scientifica. 2020; 5(6): 271-275. doi: 10.29413/ABS.2020-5.6.36

10. Ляпунова Н.А. Особенности репродукции вируса клещевого энцефалита в перевиваемых линиях клеток диких млекопитающих – резервуарных и случайных хозяев вируса. Автореф. дис. канд. биол. наук. Кольцово: ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»; 2021.

11. Gu Y, Tang S, Wang Z, et al. A pan-cancer analysis of the prognostic and immunological role of β-actin (ACTB) in human cancers. Bioengineered. 2021; 12(1): 6166- 6185. doi: 10.1080/21655979.2021.1973220

12. Higuera A, Muñoz M, López MC, et al. Succinate dehydrogenase gene as a marker for studying Blastocystis genetic diversity. Heliyon. 2020; 6(11): e05387. doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e05387

13. Ляпунова Н.А., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Соловаров И.С. Разработка ОТ-рвПЦР для оценки экспрессии генов «домашнего хозяйства» ACTB и SDHA в культурах клеток млекопитающих-хозяев зоонозных инфекций. Acta Biomedica Scientifica. 2024; 9(5): 84-95. doi: 10.29413/ABS.2024-9.5.9

14. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci. Rep. 2017; 7(1): 2409. doi: 10.1038/s41598-017-02217-x

15. Walpole RE, Myers RH, Myers SL, et al. Probability and statistics for engineers and scientists, 8th ed. Upper Saddle River: Pearson Education. 2007: 791.

16. Rogers-Broadway KR, Karteris E. Amplification efficiency and thermal stability of qPCR instrumentation: Current landscape and future perspectives. Exp Ther Med. 2015; 10(4): 1261-1264. doi: 10.3892/etm.2015.2712

17. Hays A, Islam R, Matys K, et al. Best Practices in qPCR and dPCR Validation in Regulated Bioanalytical Laboratories. AAPS J. 2022; 24(2): 36. doi: 10.1208/s12248-022-00686-1

18. Limothai U, Chuaypen N, Poovorawan K, et al. Reverse transcriptase droplet digital PCR vs reverse transcriptase quantitative real-time PCR for serum HBV RNA quantification. J. Med. Virol. 2020; 92(12): 3365-3372. doi: 10.1002/jmv.25792

19. Whale AS, von der Heide EK, Kohlenberg M, et al. Digital PCR can augment the interpretation of RT-qPCR Cq values for SARS-CoV-2 diagnostics. Methods. 2022; 201: 5-14. doi: 10.1016/j.ymeth.2021.08.006