Модификация протокола исследования функциональной активности оттаявших после криоконсервации Т-лимфоцитов

Обоснование. Иммунологические исследования невозможны без длительного хранения биоматериала в условиях криоконсервации. Стандартные методики работы с мононуклеарными лейкоцитами, подвергавшимися криоконсервации, отсутствуют.
Цель исследования. Оптимизировать протокол культивирования оттаявших после криоконсервации Т-лимфоцитов по оценке их жизнеспособности и пролиферативной активности.
Методы. Мононуклеарные лейкоциты выделяли из периферической крови относительно здоровых добровольцев (n = 18). Клетки подвергали контролируемому замораживанию до –80 °С и переносили в жидкий азот. Первый этап: после оттаивания клетки окрашивали CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester), делили на две части и культивировали в присутствии/ отсутствии интерлейкина 2 (ИЛ-2). Пролиферацию клеток стимулировали фитогемагглютинином-П. Клетки инкубировали в течение 7 суток. Анализ образцов проводили методом проточной цитофлюориметрии. Второй этап: оттаявшие клетки делили на три части. Две части ресуспендировали в полной питательной среде с ИЛ-2 и помещали в термостат (+37 °С) для «отдыха» на 1 час или на ночь. После «отдыха» клетки окрашивали CFSE. Третью часть размороженных лейкоцитов окрашивали CFSE сразу после оттаивания. Клетки стимулировали, культивировали и анализировали единообразно на обоих этапах исследования.
Результаты. Установлено, что добавление ИЛ-2 в культуральную среду способствует лучшему выживанию клеток. Кроме того, в присутствии ИЛ-2 стимулированные CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты производят больше дочерних генераций. По сравнению с пробами, сразу помещёнными в культуру, в пробах, прошедших «отдых», снижено число лейкоцитов по окончании 7-суточной инкубации. Количество дочерних генераций, формируемых стимулированными CD4+ и CD8+ Т-клетками, снижается при включении этапа «отдых» в протокол исследования.
Заключение. Внесение ИЛ-2 в культуральную среду может увеличить жизнеспособность и митотическую активность размороженных Т-клеток, приближая их состояние к таковому свежевыделенных лимфоцитов. «Отдых» клеток после оттаивания оказывает негативный эффект на жизнеспособность и пролиферативную активность Т-лимфоцитов при их последующей недельной инкубации.

1. Annaratone L, De Palma G, Bonizzi G, Sapino A, Botti G, Berrino E, et al. Basic principles of biobanking: From biological samples to precision medicine for patients. Virchows Arch. 2021; 479(2): 233-246. doi: 10.1007/s00428-021-03151-0

2. Capelle CM, Ciré S, Ammerlaan W, Konstantinou M, Balling R, Betsou F, et al. Standard peripheral blood mononuclear cell cryopreservation selectively decreases detection of nine clinically relevant T cell markers. Immunohorizons. 2021; 5(8): 711-720. doi: 10.4049/immunohorizons.2100049

3. Li B, Yang C, Jia G, Liu Y, Wang N, Yang F, et al. Comprehensive evaluation of the effects of long-term cryopreservation on peripheral blood mononuclear cells using flow cytometry. BMC Immunol. 2022; 23(1): 30. doi: 10.1186/s12865-022-00505-4

4. Freer G, Rindi L. Intracellular cytokine detection by fluorescence- activated flow cytometry: Basic principles and recent advances. Methods. 2013; 61(1): 30-38. doi: 10.1016/j.ymeth.2013.03.035

5. Horton H, Thomas EP, Stucky JA, Frank I, Moodie Z, Huang Y, et al. Optimization and validation of an 8-color intracellular cytokine staining (ICS) assay to quantify antigen-specific T cells induced by vaccination. J Immunol Methods. 2007; 323(1): 39-54. doi: 10.1016/j.jim.2007.03.002

6. Santos R, Buying A, Sabri N, Yu J, Gringeri A, Bender J, et al. Improvement of IFNg ELISPOT performance following overnight resting of frozen PBMC samples confirmed through rigorous statistical analysis. Cells. 2015; 4(1): 1-18. doi: 10.3390/cells4010001

7. Janetzki S, Panageas KS, Ben-Porat L, Boyer J, Britten CM, Clay TM, et al. Results and harmonization guidelines from two large-scale international ELISPOT proficiency panels conducted by the Cancer Vaccine Consortium (CVC/SVI). Cancer Immunol Immunother. 2008; 57(3): 303-315. doi: 10.1007/s00262-007-0380-6

8. Britten CM, Gouttefangeas C, Welters MJ, Pawelec G, Koch S, Ottensmeier C, et al. The CIMT-monitoring panel: A twostep approach to harmonize the enumeration of antigen-specific CD8+ T lymphocytes by structural and functional assays. Cancer Immunol Immunother. 2008; 57(3): 289-302. doi: 10.1007/s00262- 007-0378-0

9. Kutscher S, Dembek CJ, Deckert S, Russo C, Körber N, Bogner JR, et al. Overnight resting of PBMC changes functional signatures of antigen specific T cell responses: Impact for immune monitoring within clinical trials. PLoS One. 2013; 8(10): 76215. doi: 10.1371/journal.pone.0076215

10. Boaz MJ, Hayes P, Tarragona T, Seamons L, Cooper A, Birungi J, et al. Concordant proficiency in measurement of T-cell immunity in human immunodeficiency virus vaccine clinical trials by peripheral blood mononuclear cell and enzyme-linked immunospot assays in laboratories from three continents. Clin Vaccine Immunol. 2009; 16(2): 147-155. doi: 10.1128/CVI.00326-08

11. Wang H, Tsao ST, Gu M, Fu C, He F, Li X, et al. A simple and effective method to purify and activate T cells for successful generation of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells from patients with high monocyte count. J Transl Med. 2022; 20(1): 608. doi: 10.1186/s12967-022-03833-6

12. Mora-Buch R, Tomás-Marín M, Enrich E, Antón-Iborra M, Martorell L, Valdivia E, et al. Virus-specific T cells from cryopreserved blood during an emergent virus outbreak for a potential off-theshelf therapy. Transplant Cell Ther. 2023; 29(9): 572.e1-572.e13. doi: 10.1016/j.jtct.2023.06.001

13. Herda S, Heimann A, Obermayer B, Ciraolo E, Althoff S, Ruß J, et al. Long-term in vitro expansion ensures increased yield of central memory T cells as perspective for manufacturing challenges. Int J Cancer. 2021; 148(12): 3097-3110. doi: 10.1002/ijc.33523

14. Clarkson BD, Johnson RK, Bingel C, Lothaller C, Howe CL. Preservation of antigen-specific responses in cryopreserved CD4(+) and CD8(+) T cells expanded with IL-2 and IL-7. J Transl Autoimmun. 2022; 5: 100173. doi: 10.1016/j.jtauto.2022.100173

15. Sarkar S, Kalia V, Montelaro RC. Caspase-mediated apoptosis and cell death of rhesus macaque CD4+ T-cells due to cryopreservation of peripheral blood mononuclear cells can be rescued by cytokine treatment after thawing. Cryobiology. 2003; 47(1): 44-58. doi: 10.1016/s0011-2240(03)00068-3

16. Baust JM, Buskirk RV, Baust JG. Cell viability improves following inhibition of cryopreservation-induced apoptosis. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2000; 36(4): 262. doi: 10.1290/1071-2690(2000)036<0262:cvifio>2.0.co;2

17. Fu Y, Dang W, He X, Xu F, Huang H. Biomolecular pathways of cryoinjuries in low-temperature storage for mammalian specimens. Bioengineering (Basel). 2022; 9(10): 545. doi: 10.3390/bioengineering9100545

18. Benczik M, Gaffen SL. The interleukin (IL)-2 family cytokines: Survival and proliferation signaling pathways in T lymphocytes. Immunol Invest. 2004; 33(2): 109-142. doi: 10.1081/imm-120030732

19. Abbas AK. The surprising story of IL-2: From experimental models to clinical application. Am J Pathol. 2020; 190(9): 1776-1781. doi: 10.1016/j.ajpath.2020.05.007

20. Leonard WJ, O’Shea JJ, Jaks and STATs: Biological implications. Annu Rev Immunol. 1998; 16: 293-322. doi: 10.1146/annurev. immunol.16.1.293

21. Friedmann MC, Migone TS, Russell SM, Leonard WJ. Different interleukin 2 receptor beta-chain tyrosines couple to at least two signaling pathways and synergistically mediate interleukin 2-induced proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93(5): 2077- 2082. doi: 10.1073/pnas.93.5.2077

22. Lali FV, Crawley J, McCulloch DA, Foxwell BM. A late, prolonged activation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway is required for T cell proliferation. J Immunol. 2004; 172(6): 3527- 3534. doi: 10.4049/jimmunol.172.6.3527

23. Mui AL, Wakao H, O’Farrell AM, Harada N, Miyajima A. Interleukin-3, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, and interleukin-5 transduce signals through two forms of STAT5. J Leukoc Biol. 1995; 57(5): 799-803. doi: 10.1002/jlb.57.5.799

24. Malek TR, Castro I. Interleukin-2 receptor signaling: At the interface between tolerance and immunity. Immunity. 2010; 33(2): 153-165. doi: 10.1016/j.immuni.2010.08.004

25. Kuerten S, Batoulis H, Recks MS, Karacsony E, Zhang W, Subbramanian RA, et al. Resting of cryopreserved PBMC does not generally benefit the performance of antigen-specific T cell ELISPOT assays. Cells. 2012; 1(3): 409-427. doi: 10.3390/cells1030409

26. Smith JG, Joseph HR, Green T, Field JA, Wooters M, Kaufhold RM, et al. Establishing acceptance criteria for cell-mediatedimmunity assays using frozen peripheral blood mononuclear cells stored under optimal and suboptimal conditions. Clin Vaccine Immunol. 2007; 14(5): 527-537. doi: 10.1128/CVI.00435-06

27. Lenders K, Ogunjimi B, Beutels P, Hens N, Van Damme P, Berneman ZN, et al. The effect of apoptotic cells on virusspecific immune responses detected using IFN-gamma ELISPOT. J Immunol Methods. 2010; 357(1-2): 51-54. doi: 10.1016/j.jim.2010.03.00128

28. Zorn E, Nelson EA, Mohseni M, Porcheray F, Kim H, Litsa D, et al. IL-2 regulates FOXP3 expression in human CD4+CD25+ regulatory T cells through a STAT-dependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo. Blood. 2006; 108(5): 1571-1579. doi: 10.1182/blood-2006-02- 004747

29. Oh S, Berzofsky JA, Burke DS, Waldmann TA, Perera LP. Coadministration of HIV vaccine vectors with vaccinia viruses expressing IL-15 but not IL-2 induces long-lasting cellular immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(6): 3392-3397. doi: 10.1073/pnas.0630592100