Сайдакова Евгения Владимировна – доктор биологических наук, заведующая лабораторией молекулярной иммунологии; профессор биологического факультета
614081, г. Пермь, ул. Голева, 13
614068, г. Пермь, ул. Букирева, 15
Evgeniya V. Saidakova – Dr. Sc. (Biol.), Head of the Laboratory of Molecular Immunology; Professor at the Biological Facultym
Goleva str. 13, Perm 614081
Bukireva str. 15, Perm 614068
Королевская Лариса Борисовна – кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии
614081, г. Пермь, ул. Голева, 13
Larisa B. Korolevskaya – Cand. Sc. (Med.), Research Officer at the Laboratory of Ecological Immunology
Goleva str. 13, Perm 614081
Пономарева Валерия Николаевна – студент биологического факультета
614068, г. Пермь, ул. Букирева, 15
Valeria N. Ponomareva – Student
Bukireva str. 15, Perm 614068
Власова Виолетта Викторовна – младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии
614081, г. Пермь, ул. Голева, 13
Violetta V. Vlasova – Junior Research Officer at the Laboratory of Molecular Immunology
Goleva str. 13, Perm 614081
Обоснование. Иммунологические исследования невозможны без длительного хранения биоматериала в условиях криоконсервации. Стандартные методики работы с мононуклеарными лейкоцитами, подвергавшимися криоконсервации, отсутствуют.Цель исследования. Оптимизировать протокол культивирования оттаявших после криоконсервации Т-лимфоцитов по оценке их жизнеспособности и пролиферативной активности.Методы. Мононуклеарные лейкоциты выделяли из периферической крови относительно здоровых добровольцев (n = 18). Клетки подвергали контролируемому замораживанию до –80 °С и переносили в жидкий азот. Первый этап: после оттаивания клетки окрашивали CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester), делили на две части и культивировали в присутствии/ отсутствии интерлейкина 2 (ИЛ-2). Пролиферацию клеток стимулировали фитогемагглютинином-П. Клетки инкубировали в течение 7 суток. Анализ образцов проводили методом проточной цитофлюориметрии. Второй этап: оттаявшие клетки делили на три части. Две части ресуспендировали в полной питательной среде с ИЛ-2 и помещали в термостат (+37 °С) для «отдыха» на 1 час или на ночь. После «отдыха» клетки окрашивали CFSE. Третью часть размороженных лейкоцитов окрашивали CFSE сразу после оттаивания. Клетки стимулировали, культивировали и анализировали единообразно на обоих этапах исследования.Результаты. Установлено, что добавление ИЛ-2 в культуральную среду способствует лучшему выживанию клеток. Кроме того, в присутствии ИЛ-2 стимулированные CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты производят больше дочерних генераций. По сравнению с пробами, сразу помещёнными в культуру, в пробах, прошедших «отдых», снижено число лейкоцитов по окончании 7-суточной инкубации. Количество дочерних генераций, формируемых стимулированными CD4+ и CD8+ Т-клетками, снижается при включении этапа «отдых» в протокол исследования.Заключение. Внесение ИЛ-2 в культуральную среду может увеличить жизнеспособность и митотическую активность размороженных Т-клеток, приближая их состояние к таковому свежевыделенных лимфоцитов. «Отдых» клеток после оттаивания оказывает негативный эффект на жизнеспособность и пролиферативную активность Т-лимфоцитов при их последующей недельной инкубации.
Background. Immunological studies are impossible without long-term storage of cryopreserved biomaterial. There are no standard procedures for working with cryopreserved mononuclear leukocytes.The aim of the study. To optimize the protocol for culturing T lymphocytes thawed after cryopreservation by assessing their viability and proliferative capacity.Methods. Mononuclear leukocytes were isolated from the peripheral blood of relatively healthy volunteers (n = 18). Cells were subjected to controlled freezing down to –80 °C and were transferred to liquid nitrogen. First step: after thawing, the cells were stained with CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester), were divided into two parts and cultured in the presence/absence of interleukin 2 (IL-2). Cell proliferation was stimulated with phytohemagglutinin (type P). Cells were incubated for 7 days. Sample analysis was performed using flow cytometry. Second stage: thawed cells were divided into three parts. Two parts were resuspended in a full growth medium with IL-2 and were placed in a thermostat (+37 °C) to “rest” for one hour or overnight. After “resting”, the cells were stained with CFSE. One third of the thawed leukocytes were stained with CFSE immediately after thawing. Cells were stimulated, cultured and analyzed the same way at both stages of the study.Results. It has been established that adding IL-2 to the culture medium contributes to a better cell survival. In the presence of IL-2, stimulated CD4+ and CD8+ T lymphocytes produced more daughter cell generations. At the end of the 7-day incubation “rested” samples had reduced leukocyte counts compared to the samples that were cultured immediately after thawing. The number of daughter cell generations formed by stimulated CD4+ and CD8+ T cells decreased when the “rest” stage was included into the study protocol.Conclusion. Adding IL-2 into culture medium can increase the viability and mitotic capacity of thawed T cells, making their state more similar to that of freshly isolated lymphocytes. Cell “rest” after thawing negatively affects the viability and proliferative activity of T lymphocytes during their weekly incubation.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.