Исследование действия ингибиторов синтеза белка на растущие бактерии Escherichia coli с помощью электрохимических сенсоров

   Обоснование. Изучение механизмов действия антибиотиков требует комплексного использования традиционных микробиологических и физико-химических методов.
   Цель исследования. Изучить ответ бактерий Escherichia coli на действие четырёх антибиотиков, ингибиторов синтеза белка, используя комплексный подход.
   Методы. Бактерии выращивались в аэробных условиях на минимальной среде М9 с глюкозой. Испытывалось действие тетрациклина, канамицина, стрептомицина и хлорамфеникола. Определяли влияние антибиотиков на выживаемость (CFU) и скорость роста. Дыхательную активность, продукцию сульфида, экстраклеточный калий, а также рН и Eh среды измеряли, используя электрохимические сенсоры, непосредственно в растущей культуре в режиме «real time», мембранный потенциал – с помощью красителя DiBAC и флуоресцентного микроскопа Leica DM2000.
   Результаты. Испытуемые антибиотики по своим свойствам разделяются на две группы. Тетрациклин и хлорамфеникол обладали выраженным бактериостатическим действием, ингибирование роста начиналось сразу после добавления антибиотиков и происходило с высокой скоростью. Оба антибиотика ингибировали дыхание, стимулировали продукцию сульфида и скачок Eh. Бактерии, обработанные тетрациклином и хлорамфениколом, лучше сохраняли способность к поддержанию мембранного потенциала и удержанию внутриклеточного калия. Ингибирование дыхания приводило к снижению катаболизма глюкозы, о чём свидетельствовала более низкая ьскорость закисления среды по сравнению с контролем. Ингибирование роста стрептомицином и канамицином начиналось с 30-минутной задержкой. Оба антибиотика оказывали бактерицидное действие, не стимулировали продукцию сульфида и скачок Eh, не ингибировали дыхание, но стимулировали падение мембранного потенциала и внутриклеточного калия. Высокая дыхательная активность способствовала катаболизму глюкозы, о чём свидетельствовало быстрое закисление среды. Интерес представляет обнаружение индуцируемой канамицином продукции сульфида при росте E. coli на среде MOPS.
   Заключение. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что применение электрохимических сенсоров в сочетании с традиционными методами является перспективным подходом к изучению механизмов действия антибиотиков.

1. Oktyabrskii O. N., Smirnova G. V. Redox potential changes in bacterial cultures under tress conditions. Microbiology. 2012; 81 (2): 131-142.

2. Tyulenev A., Smirnova G., Muzyka N., Ushakov V., Oktyabrsky O. The role of sulfides in stress-induced changes of Eh in Escherichia coli cultures. Bioelectrochem. 2018; 121: 11-17. doi: 10.1016/j.bioelechem.2017.12.012

3. Smirnova G. V., Tyulenev A. V., Bezmaternykh K. V., Muzyka N. G., Ushakov V. Y., Oktyabrsky O. N. Cysteine homeostasis under inhibition of protein synthesis in Escherichia coli cells. Amino Acids. 2019; 51: 1577-1592. doi: 10.1007/s00726-019-02795-2

4. Miller J. H. Experiments in molecular genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1972.

5. Wickens H. J., Pinney R. J., Mason D. J., Gant V. A. Flow cytometric investigation of filamentation, membrane patency and membrane potential in Escherichia coli following ciprofloxacin exposure. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44: 682-687. doi: 10.1128/aac.44.3.682-687.2000

6. Landwall P., Holm T. Removal of inhibitors of bacterial growth by dialysis culture. J Gen Microbiol. 1977; 103: 345-352. doi: 10.1099/00221287-103-2-345

7. Lobritz M. A., Belenky P., Porter C. B. M., Gutierrez A., Yang J. H., Schwarz E. G., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112: 8173-8180. doi: 10.1073/pnas.1509743112

8. Potrykus K., Murphy H., Philippe N., Cashel M. ppGpp is the major source of growth rate control in E. coli. Environ Microbiol. 2011; 13: 563-575. doi: 10.1111/j.1462-2920.2010.02357.x

9. Spira B., Ospino K. Diversity in E. coli (p)ppGpp levels and its consequences. Front Microbiol. 2020; 11: 1759. doi: 10.3389/fmicb.2020.01759

10. Boehm A., Steiner S., Zaehringer F., Casanova A., Hamburger F., Ritz D., et al. Second messenger signaling governs Escherichia coli biofilm induction upon ribosomal stress. Mol Microbiol. 2009; 72: 1500-1516. doi: 10.1111/j.1365-2958.2009.06739.x

11. Park S., Imlay J. A. High levels of intracellular cysteine promote oxidative DNA damage by driving the Fenton reaction. J Bacteriol. 2003; 185: 1942-1950. doi: 10.1128/JB.185.6.1942-1950.2003

12. Shatalin K., Shatalina E., Mironov E., Nudler E. A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 2011; 334: 986-990. doi: 10.1126/science.1209855

13. Mironov E., Seregina T., Nagornykh M., Luhachack L. G., Korolkova N., Lopes L. E., et al. Mechanism of H₂S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 2017; 114(23): 6022-6027. doi: 10.1073/pnas.1703576114