ЗИМОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПРОТЕАЗ VIBRIO CHOLERAE O1 И О139 СЕРОГРУПП

Цель. Зимографический анализ водорастворимых протеаз V cholerae eltor 01 и V. cholerae О139 серогрупп. Материалы и методы. Бактерии культивировали на казеин-дрожжевом агаре (рН 7,6) при 37 °С в течение одних суток и смывали физиологическим раствором. Бактериальную массу (концентрацией 109 кл./мл) обрабатывали стерильным раствором мочевины в конечной концентрации 4,5 М. После суточной экспозиции и определения стерильности полученного лизата нерастворимый в мочевине материал (клеточные оболочки) удаляли высокоскоростным центрифугированием. Надосадочную жидкость подвергали диализу, освобождали от нерастворимого в воде осадка центрифугированием и лиофильно высушивали. Протеазную активность определяли в диффузионном тесте в 1% агарозном геле, содержащем 0,5 % желатина или 0,5 % казеина. Спектр протеаз анализировали субстратным электрофорезом в блоках 8% полиакриламидного геля, импрегнированного в процессе полимеризации желатином или казеином (в конечной концентрации 0,1 %), в присутствии додецилсульфата натрия. Результаты. После дифференциального центрифугирования мочевинного лизата клеток и диализа в исследуемых экстрактах остаются преимущественно внутриклеточные водорастворимые протеазы. Диффузионные тесты показали, что все препараты исследуемых штаммов холерного вибриона обладают протеазной активностью разной интенсивности. Смена субстрата в диффузионном тесте с желатина на казеин привела к общему уменьшению регистрируемых зон гидролиза,указывая, что казеин расщепляется менее активно в сравнении с желатином. Субстратный электрофорез показал, что белки, составляющие спектр водорастворимых протеаз холерного вибриона, извлекаемых мочевиной, обладают молекулярной массой, варьирующей в пределах от менее 30 кДа до более 120 кДа. Отмечаются штаммовые различия в количественной и качественной характеристике спектров растворимых протеаз. Выявлена зависимость характеристики профиля водорастворимых протеаз от используемого субстрата. При оценке спектров протеаз получено четкое подтверждение, что на гелях, импрегнированных желатином, электрофоретическая подвижность протеаз выше, чем в гелях, содержащих казеин. Заключение. Субстратный электрофорез препаратов бесклеточных лизатов холерного вибриона показал наличие нескольких водорастворимых протеаз, количественные и качественные межштаммовые различия, зависимость спектра активных протеаз от используемого субстрата.

субстратный электрофорез, мочевинные экстракты, протеазы V. cholerae, зимография

1. Наружные мембраны холерного вибриона как потенциальный компонент химической вакцины / Е.Ю. Марков [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1995. - № 2. - С. 86-89.

2. Плазминоген-активирующая способность холерного вибриона и участие мембранного белка OmpT в этом процессе / Е.С. Шипко [и др.] // Здоровье населения и среда обитания. - 2012. - № 4. - С. 17-19.

3. Получение высокоиммуногенного препарата наружных мембран Vibrio cholerae eltor / Е.Ю. Марков [и др.] // Журн. инфекционной патологии. - 1998. -Т. 5, № 4. - С. 42-48.

4. Протеазный спектр наружных мембран Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп / В.Б. Николаев [и др.] // Журн. инфекционной патологии. - 2009. - Т. 16, № 3. - С. 41-44.

5. A Vibrio cholerae protease needed for killing of Caenorhabditis elegans has a role in protection from natural predator grazing / K. Vaitkevicius [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. - Vol. 103, N 24. - P. 92809285.

6. Heussen C., Dowdle E.B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates // Anal. Biochem. - 1980. - Vol. 102, N 1. - P. 196-202.

7. Ingmer H., Br0ndsted L. Proteases in bacterial pathogenesis // Res. Microbiol. - 2009. - Vol. 160, N 9. -P. 704-710.

8. Lantz M. S., Ciborowski P. Zymographic techniques for detection and characterization of microbial proteases // Methods Enzymol. - 1994. - Vol. 235. - P. 563-594.

9. Lopez-Otin C., Bond J.S. Proteases: multifunctional enzymes in life and disease // J. Biol. Chem. - 2008. -Vol. 283, N 45. - P. 30433-30437.

10. Matson J., DiRita V.J. Degradation of the membrane-localized virulence activator TcpP by the YaeL protease in Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 102, N 45. - P. 16403-16408. Сведения об авторах

11. Nelson D.C., Garbe J., Collin M. Cysteine proteinase SpeB from Streptococcus pyogenes - a potent modifier of immunologically important host and bacterial proteins // Biochem. - 2011. - Vol. 392, N 12. - P. 1077-1088.

12. Potempa J., Pike R. Corruption of innate immunity by bacterial proteases // J. Innate Immun. - 2009. - Vol. 1, N 2. - P. 70-87.

13. Proteinases of common pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide LL-37 / A. Schmidtchen, I. M. Frick, E. Andersson [et al.] // Mol. Microbiol. - 2002. - Vol. 46, N 1. - P. 157-168.

14. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae / J. Zhu [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - Vol. 99, N 5. -P. 3129-3134.

15. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the peptidase database // Nucl. Acids Res. - 2010. -Vol. 38, Database issue. - P. D227-D233.

16. Shinoda S. Proteases produced by Vibrio cholerae and other pathogenic vibrios: pathogenic roles and expression // Epidemiological and Molecular Aspects on Cholera / Eds. T. Ramamurthy, S.K. Bhattacharya. - New York : Springer, 2011. - P. 245-258.

17. Stewart-Tull D.E., Bleakley C.R., Galloway T.S. Characteristics of Vibrio cholerae proteinases: potential, candidate vaccine antigens // Vaccine. - 2004. - Vol. 22, N 23-24. - P. 3026-3034.

18. Turk B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects // Nat. Rev. Drug. Discov. - 2006. -Vol. 5, N 9. - P. 785-789.

19. Vance R.E., Zhu J., Mekalanos J.J. A constitutively active variant of the quorum-sensing regulator LuxO affects protease production and biofilm formation in Vibrio cholerae // Infect. Immun. - 2003. - Vol. 71, N 5. - P. 2571-2576.