Цель. Зимографический анализ водорастворимых протеаз V cholerae eltor 01 и V. cholerae О139 серогрупп. Материалы и методы. Бактерии культивировали на казеин-дрожжевом агаре (рН 7,6) при 37 °С в течение одних суток и смывали физиологическим раствором. Бактериальную массу (концентрацией 109 кл./мл) обрабатывали стерильным раствором мочевины в конечной концентрации 4,5 М. После суточной экспозиции и определения стерильности полученного лизата нерастворимый в мочевине материал (клеточные оболочки) удаляли высокоскоростным центрифугированием. Надосадочную жидкость подвергали диализу, освобождали от нерастворимого в воде осадка центрифугированием и лиофильно высушивали. Протеазную активность определяли в диффузионном тесте в 1% агарозном геле, содержащем 0,5 % желатина или 0,5 % казеина. Спектр протеаз анализировали субстратным электрофорезом в блоках 8% полиакриламидного геля, импрегнированного в процессе полимеризации желатином или казеином (в конечной концентрации 0,1 %), в присутствии додецилсульфата натрия. Результаты. После дифференциального центрифугирования мочевинного лизата клеток и диализа в исследуемых экстрактах остаются преимущественно внутриклеточные водорастворимые протеазы. Диффузионные тесты показали, что все препараты исследуемых штаммов холерного вибриона обладают протеазной активностью разной интенсивности. Смена субстрата в диффузионном тесте с желатина на казеин привела к общему уменьшению регистрируемых зон гидролиза,указывая, что казеин расщепляется менее активно в сравнении с желатином. Субстратный электрофорез показал, что белки, составляющие спектр водорастворимых протеаз холерного вибриона, извлекаемых мочевиной, обладают молекулярной массой, варьирующей в пределах от менее 30 кДа до более 120 кДа. Отмечаются штаммовые различия в количественной и качественной характеристике спектров растворимых протеаз. Выявлена зависимость характеристики профиля водорастворимых протеаз от используемого субстрата. При оценке спектров протеаз получено четкое подтверждение, что на гелях, импрегнированных желатином, электрофоретическая подвижность протеаз выше, чем в гелях, содержащих казеин. Заключение. Субстратный электрофорез препаратов бесклеточных лизатов холерного вибриона показал наличие нескольких водорастворимых протеаз, количественные и качественные межштаммовые различия, зависимость спектра активных протеаз от используемого субстрата.
Aim. Zymographic analysis of water-soluble proteases of Vibrio cholerae O1 и О139 serogroups. Materials and methods. Bacteria cultivated on a casein-yeast agar (рН 7,6) at 37 ° with during one twenty-four hours and washed off physiological solution. Bacterial mass (by the concentration of 109 cell./ml) was treatment by sterile solution of urea in an eventual concentration 4,5 М. After day's display and determination of sterility of got lysate insoluble in urea material (cell walls) was deleted by high-speed centrifugation. Supernatant liquid was exposed to the dialysis, released from insoluble in water sediment centrifugation and freeze dried out. Protease activity was determined in diffusion test in 1 % agarose gel, containing 0,5 % gelatin or 0,5% casein. The spectrum of proteases was analysed by a substrate electrophoresis in the blocks of 8% polyacrylamide gel, impregnated in the process of polymerization gelatin or casein (in an eventual concentration 0,1 %), in presence the dodecylsulphate of sodium. Results. After differential centrifugation of ureal lysate of cells and dialysis there are mainly intracellular water-soluble proteases in the investigated extracts. Diffusion tests showed that all preparations of the investigated strains of Vibrio cholerae possessed protease activity of different intensity. Changing of substrate in diffusion test from gelatin to the casein resulted in the general diminishing of the registered areas of hydrolysis, specifying that a casein fissions less actively by comparison to gelatin. Substrate electrophoresis showed that proteins, making the spectrum of water-soluble pro teases of Vibrio cholerae are extracted by urea, possessed molecular mass, varying within from less than 30 кйа to more than 120 кDа. Strains distinctions are marked in quantitative and high-quality description of spectrums of soluble proteases. Dependence of description of type of water-soluble proteases is educed on used substrate. At the estimation of spectrums of proteases clear confirmation is got, that on gels are impregnated by gelatin electrophoretic mobility of proteases is higher, than in gels, containing a casein. Conclusion. Substrate electrophoresis of preparations of cell-free lysates of Vibrio cholerae showed the presence of a few water-soluble proteases, quantitative and high-quality interstrain distinctions, dependence of spectrum of active proteases from of used substrate.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.