Разработка подходов к селекции ДНК-аптамеров на основе мембранной ультрафильтрации комплекса аптамер – мишень

Обоснование. Аптамеры – небольшие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК, обладающие аффинностью к определённой молекуле-мишени. Основным методом получения аптамеров является их отбор с помощью технологии систематической эволюции лигандов с экспоненциальным обогащением (SELEX) к целевой молекуле. Однако способ получения аптамеров зависит от целевого агента и подбирается и оптимизируется каждым исследователем самостоятельно. В данной статье описано получение аптамеров к изоляту вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) сибирского субтипа с помощью фильтрационных колонок Vivaspin 6 (Sartorius, Германия) с отсекающей массой 100 кДа. Разработанная методика получения аптамеров позволила получить пул аффинных аптамеров к ВКЭ.
Цель исследования. Разработать метод отбора ДНК-аптамеров, пригодный для получения аптамеров к живой, неочищенной вирусной суспензии вируса клещевого энцефалита, получаемой наработкой от клеточной культуры.
Методы. Отбор аптамеров осуществляли на основе модифицированной технологии SELEX с использованием полупроницаемой мембраны. Обогащение специфичного пула аптамеров выполняли с помощью полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени. Расшифровку нуклеотидных последовательностей аптамеров производили с помощью секвенирования по Сенгеру. Прямое вирулицидное действие аптамеров определяли по снижению титра инфекционного вируса после инкубирования с аптамером.
Результаты. Разработан метод проведения отбора аффинных ДНКаптамеров к ВКЭ с использованием центрифугирования на фильтрационных колонках Vivaspin 6 (Sartorius, Германия) с отсекающей массой 100 кДа. Проверка ингибирующих свойств ДНК-аптамеров против ВКЭ четырёх выбранных последовательностей не показала активности.
Заключение. Описанный метод получения ДНК-аптамеров с использованием колонок Vivaspin может быть успешно применён для получения аптамеров к живой вирусной культуре для вирусов, сопоставимых по размерам с ВКЭ, или крупнее.

1. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 1990; 249(4968): 505-510. doi: 10.1126/science.2200121

2. Garst AD, Edwards AL, Batey RT. Riboswitches: Structures and mechanisms. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011; 3(6): a003533. doi: 10.1101/cshperspect.a003533

3. Jellinek D, Green LS, Bell C, Janjić N. Inhibition of receptor binding by high-affinity RNA ligands to vascular endothelial growth factor. Biochemistry. 1994; 33(34): 10450-10456. doi: 10.1021/bi00200a028

4. Kaur H, Bruno JG, Kumar A, Sharma TK. Aptamers in the therapeutics and diagnostics pipelines. Theranostics. 2018; 8(15): 4016-4032. doi: 10.7150/thno.25958

5. Jain RK. The next frontier of molecular medicine: delivery of therapeutics. Nat Med. 1998; 4(6): 655-657. doi: 10.1038/nm0698-655

6. Winkler J. Therapeutic oligonucleotides with polyethylene glycol modifications. Future Med Chem. 2015; 7(13): 1721-1731. doi: 10.4155/fmc.15.94

7. Huang Y, Zhang L, Li Z, Gopinath SCB, Chen Y, Xiao Y. Aptamer-17β-estradiol-antibody sandwich ELISA for determination of gynecological endocrine function. Biotechnol Appl Biochem. 2020; 68(4): 881-888. doi: 10.1002/bab.2008.

8. Lobigs M, Lee E, Ng ML, Pavy M, Lobigs P. A flavivirus signal peptide balances the catalytic activity of two proteases and thereby facilitates virus morphogenesis. Virology. 2010; 401(1): 80-89. doi: 10.1016/j.virol.2010.02.008

9. Wang Y, Li Z, Yu H. Aptamer-based western blot for selective protein recognition. Front Chem. 2020; 8: 570528. doi: 10.3389/fchem.2020.570528

10. Пеньевская Н.А. Этиотропные препараты для экстренной профилактики клещевого энцефалита: перспективные разработки и проблемы эпидемиологической оценки эффективности. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010; 1(50): 39-45.

11. Eyetech Study Group. Anti-vascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration: Phase II study results. Ophthalmology. 2003; 110(5): 979-986. doi: 10.1016/S0161-6420(03)00085-X

12. Nimjee SM, White RR, Becker RC, Sullenger BA. Aptamers as therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2017; 57: 61-79. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-010716-104558

13. Gold L, Polisky B, Uhlenbeck O, Yarus M. Diversity of oligonucleotide functions. Annu Rev Biochem. 1995; 64: 763-797. doi: 10.1146/annurev.bi.64.070195.003555

14. Thomas M, Chédin S, Carles C, Riva M, Famulok M, Sentenac A. Selective targeting and inhibition of yeast RNA polymerase II by RNA aptamers. J Biol Chem. 1997; 272(44): 27980-27986. doi: 10.1074/jbc.272.44.27980

15. Brody EN, Gold L. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J Biotechnol. 2000; 74(1): 5-13. doi: 10.1016/s1389-0352(99)00004-5

16. Nimjee SM, Rusconi CP, Harrington RA, Sullenger BA. The potential of aptamers as anticoagulants. Trends Cardiovasc Med. 2005; 15(1): 41-45. doi: 10.1016/j.tcm.2005.01.002

17. Proske D, Blank M, Buhmann R, Resch A. Aptamers-basic research, drug development, and clinical applications. Appl Microbiol Biotechnol. 2005; 69(4): 367-374. doi: 10.1007/s00253-005-0193-5

18. Zhang Z, Blank M, Schluesener HJ. Nucleic acid aptamers in human viral disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2004; 52(5): 307-315.

19. Болотова Н.А., Хаснатинов М.А., Ляпунов А.В., Манзарова Э.Л., Соловаров И.С., Данчинова Г.А. Многолетние тенденции изменения поражаемости населения Прибайкалья иксодовыми клещами. Acta biomedica scientifica. 2017; 2(1): 89-93. doi: 10.12737/article_5955e6b5c91407.50206187

20. Suss J. Tick-borne encephalitis in Europe and beyond – The epidemiological situation as of 2007. Euro Surveill. 2008; 13(26): 18916.

21. Dörrbecker B, Dobler G, Spiegel M, Hufert FT. Tick-borne encephalitis virus and the immune response of the mammalian host. Travel Med Infect Dis. 2010; 8(4): 213-222. doi: 10.1016/j.tmaid.2010.05.010

22. Лучинина С.В., Семенов А.И., Степанова О.Н., Погодина В.В., Герасимов С.Г., Щербинина М.С., и др. Вакцинопрофилактика клещевого энцефалита в Челябинской области: масштабы вакцинации, популяционный иммунитет, анализ случаев заболевания привитых. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016; 1(86): 67-76.

23. Погодина В.В., Левина Л.С., Скрынник С.М., Травина Н.С., Карань Л.С., Колясникова Н.М., и др. Клещевой энцефалит с молниеносным течением и летальным исходом у многократно вакцинированного пациента. Вопросы вирусологии. 2013; 58(2): 33-37.

24. Субботин А.В., Семенов В.А., Смирнов В.Д., Щербинина М.С., Погодина В.В. Случай развития хронического клещевого энцефалита у вакцинированного пациента. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014; 3: 76.

25. Соловаров И.С., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Ляпунов А.В., Болотова Н.А., Манзарова Э.Л., и др. Оценка вируснейтрализующих свойств ДНК-аптамеров и экстрактов лекарственных растений в отношении вируса клещевого энцефалита. Acta biomedica scientifica. 2017; 2(1): 84-88. doi: 10.12737/article_5955e6b5aad2e3.30269730

26. Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Злобин В.И., Ляпунов А.В., Арбатская Е.В., Чапоргина Е.А., и др. Вирус клещевого энцефалита в Монголии. Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2012; 111(4): 9-12.

27. Gould EA, Clegg JCS. Growth, titration and purification of togaviruses. In: Mahy BWJ (ed.). Virology: A practical approach. Oxford; 1985: 43-48.