Клонирование гена метионин-аминопептидазы бактерии Thermus thermophilus и подтверждение функциональной активности фермента

Обоснование. Метионин-аминопептидазы (МАП) – это класс ферментов, которые катализируют удаление N-концевого инициирующего метионина из полипептидной цепи. Бактериальные МАП рассматриваются в качестве мишеней для разработки антибактериальных препаратов широкого спектра действия, а применение МАП в биотехнологии обуславливает поиск новых МАП, исследование механизмов их функционирования и ингибирования.
Цель исследования. Идентификация метионин-аминопептидазы в геноме Thermus thermophilus (Tt-МАП) и подтверждение её функциональной активности.
Материалы и методы. Для идентификации Tt-МАП был проведён анализ генома Thermus thermophilus в базе данных GeneBank. Для клонирования в векторе pHUE предполагаемой открытой рамки считывания (ОРС), кодирующей Tt-МАП, были использованы современные методы генной инженерии (полимеразная цепная реакция, рестрикция, трансформация, гетерологичная экспрессия). Для получения очищенного препарата фермента были использованы различные методы хроматографии (аффинная, ионообменная и эксклюзионная). Для подтверждения специфической функциональной аминопептидазной активности фермента использовали флюорогенный субстрат L-метионин 7-амино-4-метилкумарин (Met-AMC).
Результаты. В геноме бактерии Thermus thermophilus идентифицирована ОРС, кодирующая МАП. На основании нуклеотидной последовательности были составлены олигонуклеотидные праймеры. ОРС клонирована в векторе, и проведена наработка рекомбинантного фермента в клетках E. coli. С использованием ряда последовательных хроматографий разработана методика очистки фермента до гомогенного состояния, позволяющая получать до 30 мг с 1 л культуры. С использованием флюорогенного субстрата Met-AMC была показана специфическая функциональная активность фермента (фермент отщепляет метионин от субстрата).
Заключение. Нами проведена идентификация МАП Thermus thermophilus и проверка её функциональной активности. Показано, что продукт ОРС TTHA1670 кодирует специфичную к метионину аминопептидазу, т. е. метионин-аминопептидазу. Фермент может быть использован в различных отраслях биотехнологии и научных исследованиях.

1. Gamerdinger M, Deuerling E. Cotranslational sorting and processing of newly synthesized proteins in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2024; 49(2): 105-118. doi: 10.1016/j.tibs.2023.10.003

2. Chen L, Kashina A. Post-translational modifications of the protein termini. Front Cell Dev Biol. 2021; 9: 719590. doi: 10.3389/fcell.2021.719590

3. Nguyen KT, Kim JM, Park SE, Hwang CS. N-terminal methionine excision of proteins creates tertiary destabilizing N-degrons of the Arg/N-end rule pathway. J Biol Chem. 2019; 294(12): 4464-4476. doi: 10.1074/jbc.RA118.006913

4. Wingfield PT. N-terminal methionine processing. Curr Protoc Protein Sci. 2017; 88: 6.14.1-6.14.3. doi: 10.1002/cpps.29

5. Arif A, Mohammed K, Nadeem MS. Biochemical and in silico evaluation of recombinant E. coli aminopeptidase and in vitro processed human interferon alpha-2b. Turk J Biol. 2018; 42(3): 240-249. doi: 10.3906/biy-1801-83

6. Rawlings ND. Using the MEROPS database for investigation of lysosomal peptidases, their inhibitors, and substrates. Methods Mol Biol. 2017; 1594: 213-226. doi: 10.1007/978-1-4939-6934-0_14

7. Roderick SL, Matthews BW. Structure of the cobalt-dependent methionine aminopeptidase from Escherichia coli: A new type of proteolytic enzyme. Biochemistry. 1993; 32(15): 3907-3912. doi: 10.1021/bi00066a009

8. D’souza VM, Bennett B, Copik AJ, Holz RC. Divalent metal binding properties of the methionyl aminopeptidase from Escherichia coli. Biochemistry. 2000;39(13):3817-3826. doi: 10.1021/bi9925827

9. Meng L, Ruebush S, D’souza VM, Copik AJ, Tsunasawa S, Holz RC. Overexpression and divalent metal binding properties of the methionyl aminopeptidase from Pyrococcus furiosus. Biochemistry. 2002; 41(23): 7199-7208. doi: 10.1021/bi020138p

10. Bala S, Reddi B, Addlagatta A. A single amino acid difference between archaeal and human type 2 methionine aminopeptidases differentiates their affinity towards ovalicin. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2023; 1871(2): 140881. doi: 10.1016/j.bbapap.2022.140881

11. Bala SC, Haque N, Pillalamarri V, Reddi R, Kashyap R, Marapaka AK, et al. Discovery of a new class of type 1 methionine aminopeptidases that have relaxed substrate specificity. Int J Biol Macromol. 2019; 129: 523-529. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2019.02.055

12. Arya T, Reddi R, Kishor C, Ganji RJ, Bhukya S, Gumpena R, et al. Identification of the molecular basis of inhibitor selectivity between the human and streptococcal type I methionine aminopeptidases. J Med Chem. 2015; 58(5): 2350-2357. doi: 10.1021/jm501790e

13. Goya Grocin A, Kallemeijn WW, Tate EW. Targeting methionine aminopeptidase 2 in cancer, obesity, and autoimmunity. Trends Pharmacol Sci. 2021; 42(10): 870-882. doi: 10.1016/j.tips.2021.07.004

14. Friese-Hamim M, Ortiz Ruiz MJ, Bogatyrova O, Keil M, Rohdich F, Blume B, et al. Novel methionine aminopeptidase 2 inhibitor M8891 synergizes with VEGF receptor inhibitors to inhibit tumor growth of renal cell carcinoma models. Mol Cancer Ther. 2024; 23(2): 159-173. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-23-0102

15. Watanabe N, Saito-Nakano Y, Kurisawa N, Otomo K, Suenaga K, Nakano K, et al. Fumagillin inhibits growth of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica by covalently binding to and selectively inhibiting methionine aminopeptidase 2. Antimicrob Agents Chemother. 2023; 67(11): e0056023. doi: 10.1128/aac.00560-23

16. Carducci MA, Wang D, Habermehl C, Bödding M, Rohdich F, Lignet F, et al. A first-in-human, dose-escalation study of the methionine aminopeptidase 2 inhibitor M8891 in patients with advanced solid tumors. Cancer Res Commun. 2023; 3(8): 1638-1647. doi: 10.1158/2767-9764.CRC-23-0048

17. Steinberg E, Esa R, Schwob O, Stern T, Orehov N, Zamir G, Hubert A, et al. Methionine aminopeptidase 2 as a potential target in pancreatic ductal adenocarcinoma. Am J Transl Res. 2022; 14(9): 6243-6255.

18. Helgren TR, Chen C, Wangtrakuldee P, Edwards TE, Staker BL, Abendroth J, et al. Rickettsia prowazekii methionine aminopeptidase as a promising target for the development of antibacterial agents. Bioorg Med Chem. 2017; 25(3): 813-824. doi: 10.1016/j.bmc.2016.11.013

19. Zhang M, He S, Han X, Cui J, Wang H, Huo X, et al. Discovery of potential antituberculosis agents targeted methionine aminopeptidase 1 of Mycobacterium tuberculosis by the developed fluorescent probe. Anal Chem. 2023; 95(44): 16210-16215. doi: 10.1021/acs.analchem.3c02952

20. Ye M, Xiong L, Dong Y, Xie C, Zhang Z, Shen L, et al. The potential role of the methionine aminopeptidase gene PxMetAP1 in a cosmopolitan pest for Bacillus thuringiensis toxin tolerance. Int J Mol Sci. 2022; 23(21): 13005. doi: 10.3390/ijms232113005

21. Reddi B, Kishor C, Jangam A, Bala S, Rajeswari Batchu U, Gundla R, et al. Regioselectivity in inhibition of peptide deformylase from Haemophilus influenzae by 4- vs 5-azaindole hydroxamic acid derivatives: Biochemical, structural and antimicrobial studies. Bioorg Chem. 2022; 128: 106095. doi: 10.1016/j.bioorg.2022.106095

22. Bala S, Yellamanda KV, Kadari A, Ravinuthala VSU, Kattula B, Singh OV, et al. Selective inhibition of Helicobacter pylori methionine aminopeptidase by azaindole hydroxamic acid derivatives: Design, synthesis, in vitro biochemical and structural studies. Bioorg Chem. 2021; 115: 105185. doi: 10.1016/j.bioorg.2021.105185

23. Nandan A, Nampoothiri KM. Therapeutic and biotechnological applications of substrate specific microbial aminopeptidases. Appl Microbiol Biotechnol. 2020; 104(12): 5243-5257. doi: 10.1007/s00253-020-10641-9

24. Pasquini M, Grosjean N, Hixson KK, Nicora CD, Yee EF, Lipton M, et al. Zng1 is a GTP-dependent zinc transferase needed for activation of methionine aminopeptidase. Cell Rep. 2022; 39(7): 110834. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110834

25. Baker RT, Catanzariti AM, Karunasekara Y, Soboleva TA, Sharwood R, Whitney S, et al. Using deubiquitylating enzymes as research tools. Methods Enzymol. 2005; 398: 540-554. doi: 10.1016/S0076-6879(05)98044-0

26. Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 1995; 4(11): 2411-2423. doi: 10.1002/pro.5560041120

27. You C, Lu H, Sekowska A, Fang G, Wang Y, Gilles AM, et al. The two authentic methionine aminopeptidase genes are differentially expressed in Bacillus subtilis. BMC Microbiol. 2005; 5: 57. doi: 10.1186/1471-2180-5-57

28. Sievers F, Higgins DG. Clustal Omega for making accurate alignments of many protein sequences. Protein Sci. 2018; 27(1): 135-145. doi: 10.1002/pro.3290

29. Reddi R, Arya T, Kishor C, Gumpena R, Ganji RJ, Bhukya S, et al. Selective targeting of the conserved active site cysteine of Mycobacterium tuberculosis methionine aminopeptidase with electrophilic reagents. FEBS J. 2014; 281(18): 4240-4248. doi: 10.1111/febs.12847

30. Irfan I, Ali A, Reddi B, Khan MA, Hasan P, Ahmed S, et al. Design, synthesis and mechanistic studies of novel isatin-pyrazole hydrazone conjugates as selective and potent bacterial MetAP inhibitors. Antibiotics (Basel). 2022; 11(8): 1126. doi: 10.3390/antibiotics11081126

31. Lapteva YS, Bykov VV, Trunilina MV, Boldaevsky IS, Kudryashov TA, Vologzhannikova AA, et al. Obtaining overstable methionine aminopeptidase for the removal of methionine from recombinant proteins. Journal Biomed. 2023; 19(3E): 47-51. doi: 10.33647/2713-0428-19-3Е-47-51