Разработка и валидация методики количественного определения моноаминовых нейромедиаторов и их метаболитов в тканях мозга крыс с помощью ВЭЖХ-МС/МС

Обоснование. Определение изменения содержания моноаминовых нейромедиаторов и  их  метаболитов в  структурах головного мозга является необходимой частью изучения фармакодинамики противопаркинсонических лекарственных средств. Методика совместного определения норадреналина, адреналина, допамина, серотонина, 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты, гомованилиновой кислоты, ванилилминдальной кислоты в тканях мозга крыс ранее не была разработана.

Цель исследования. Разработка и  валидация методики количественного определения норадреналина, адреналина, допамина, серотонина, 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты, гомованилиновой кислоты, ванилилминдальной кислоты в  тканях мозга крыс с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС).

Методы. Методика определения моноаминовых медиаторов и их метаболитов разработана c  применением метода ВЭЖХ-МС/МС. Гомогенаты тканей мозга готовились с  помощью механического ручного гомогенизатора. Изучено влияние различных антиоксидантов на стабильность норадреналина, адреналина, допамина и 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты в испытуемых образцах.

Результаты. Хроматографическое разделение компонентов пробы осуществлялось с помощью двух хроматографических колонок Synergi Max RP (20 × 2,0 мм, 2,5 мкм) и Synergi Fusion RP 80Å (250 × 4,6 мм, 4 мкм). Элюирование проводили в градиентном режиме с применением подвижной фазы на основе метанола и 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в воде. Для подготовки проб гомогенатов использовалось разведение образцов раствором внутренних стандартов в метаноле. В качестве стабилизатора-антиоксиданта был выбран 5%-й водный раствор аскорбиновой кислоты.

Заключение. Разработанная методика прошла полную валидацию и соответствует требованиям российских и международных руководств. Выбранный способ стабилизации позволяет хранить образцы гомогенатов мозга в течение 30 дней после отбора.

1. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К; 2012.

2. Lu J, Sun F, Ma H, Qing H, Deng Y. Quantitative detection of dopamine, serotonin and their metabolites in rat model of Parkinson’s disease using HPLC-MS/MS. 2015 IEEE International Conference on Mechatronics and Automation. 2015: 1460-1465. doi: 10.1109/ICMA.2015.7237700

3. Яичков И.И., Джурко Ю.А., Шитов Л.Н. Основные ошибки в аналитической части исследований биоэквивалентности и фармакокинетики. Медицинская этика. 2018; 6(1): 33-38.

4. Хохлов А.Л., Рыска М., Кукес В.Г., Писачкова М., Печена М., Яворский А.Н., и др. Современные подходы к проведению биоаналитических исследований при создании лекарственных препаратов. М.: Российская академия наук; 2018.

5. Grouzmann E, Centeno C, Eugster PJ. Quantification of vanillylmandelic acid, homovanillic acid and 5-hydroxyindoleacetic acid in urine using a dilute-and-shoot and ultra-high pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry method. Clin Chem Lab Med. 2018; 56(9): 1533-1541. doi: 10.1515/cclm-2017-1120

6. Hwang N, Chong E, Oh H, Cho HW, Lee JW, Sung KW, et al. Application of an LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of homovanillic acid and vanillylmandelic acid for the diagnosis and follow-up of neuroblastoma in 357 patients. Molecules. 2021; 26(11): 3470. doi: 10.3390/molecules26113470

7. Fang L, Lv Y, Sheng X, Yao S. Sensitive, rapid and easy analysis of three catecholamine metabolites in human urine and serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry. J Chromatogr Sci. 2012; 50(5): 450-456. doi: 10.1093/chromsci/bms068

8. Thomas J, Khanam R, Vohora D. A validated HPLC-UV method and optimization of sample preparation technique for norepinephrine and serotonin in mouse brain. Pharm Biol. 2015; 53(10): 1539-1544. doi: 10.3109/13880209.2014.991837

9. Brenes JC, Fornaguera J. The effect of chronic fluoxetine on social isolation-induced changes on sucrose consumption, immobility behavior, and on serotonin and dopamine function in hippocampus and ventral striatum. Behav Brain Res. 2009; 198(1): 199-205. doi: 10.1016/j.bbr.2008.10.036

10. Khlebnikova NN, Orshanskaya EV, Narkevich VB, Kudrin VS, Krupina NA. Dipeptidyl peptidase 4 inhibitors diprotin A and sitagliptin administered on weeks 2–3 of postnatal development modulate monoamine metabolism in the striatum of adult rats. Bull Exp Biol Med. 2017; 163(2): 190-194. doi: 10.1007/s10517-017-3763-5

11. Krupina NA, Khlebnikova NN, Narkevich VB, Naplekova PL, Kudrin VS. The levels of monoamines and their metabolites in the brain structures of rats subjected to two- and three-monthlong social isolation. Bull Exp Biol Med. 2020; 168(5): 605-609. doi: 10.1007/s10517-020-04761-5

12. Cannazza G, Carrozzo MM, Cazzato AS, Bretis IM, Troisi L, Parenti C, et al. Simultaneous measurement of adenosine, dopamine, acetylcholine and 5-hydroxytryptamine in cerebral mice microdialysis samples by LC-ESI-MS/MS. J Pharm Biomed Anal. 2012; 71: 183-186. doi: 10.1016/j.jpba.2012.08.004

13. Jampolska M, Andrzejewski K, Zaremba M, Joniec-Maciejak I, Kaczynska K.Deficiency of biogenic amines modulates the activity of hypoglossal nerve in the reserpine model of Parkinson’s disease. Cells. 2021; 10: 531. doi: 10.3390/cells10030531

14. Greco S, Danysz W, Zivkovic A, Gross R, Stark H. Microdialysate analysis of monoamine neurotransmitters – A versatile and sensitive LC-MS/MS method. Anal Chim Acta. 2013; 771: 65-72. doi: 10.1016/j.aca.2013.02.004

15. Ji C, Walton J, Su Y, Tella M. Simultaneous determination of plasma epinephrine and norepinephrine using an integrated strategy of a fully automated protein precipitation technique, reductive ethylation labeling and UPLC-MS/MS. Anal Chim Acta. 2010; 670: 84-91. doi: 10.1016/j.aca.2010.04.051

16. Kim S, Jang EY, Song S-H, Kim JS, Ryu IS, Jeong C-H, et al. Brain microdialysis coupled to LC-MS/MS revealed that CVT-10216, a selective inhibitor of aldehyde dehydrogenase 2, alters the neurochemical and behavioral effects of methamphetamine. ACS Chem Neurosci. 2021; 12(9): 1552-1562. doi: 10.1021/acschemneuro.1c00039

17. Kovac A, Somikova Z, Zilka N, Novak M. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of panel of neurotransmitters in cerebrospinal fluid from the rat model for tauopathy. Talanta. 2014; 119: 284-290. doi: 10.1016/j.talanta.2013.10.027

18. Попов Н.С., Гавриленко Д.А., Балабаньян В.Ю., Петрова М.Б., Донсков С.А., Атаджанов И.Б., и др. Количественное определение моноаминовых нейротрансмиттеров в гомогенатах головного мозга крыс с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Фармакокинетика и Фармакодинамика. 2022; (4): 33-42.. doi: 10.37489/2587-7836-2022-4-33-42

19. Syslova K, Rambousek L, Kuzma M, Najmanova V, Bubenikova-Valesova V, Slamberova R, et al. Monitoring of dopamine and its metabolites in brain microdialysates: Method combining freeze-drying with liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A. 2011; 1218(21): 3382-3391. doi: 10.1016/j.chroma.2011.02.006

20. Xie Z, Lorkiewicz P, Riggs DW, Bhatnagar A, Srivastava S. Comprehensive, robust, and sensitive UPLC-MS/MS analysis of free biogenic monoamines and their metabolites in urine. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2018; 1099: 83-91. doi: 10.1016/j.jchromb.2018.09.012

21. Хохлов А.Л., Яичков И.И., Джурко Ю.А., Рыска М., Кубеш В., Шитов Л.Н. Подходы к разработке биоаналитических методик для определения нестабильных соединений в биологических жидкостях. Acta biomedica scientifica. 2018; 3(5): 106-115. doi: 10.29413/ABS.2018-3.5.16

22. ICH guideline M10 on bioanalytical method validation and study sample analysis. 2022. URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-guideline-m10-bioanalytical-method-validation-step-5_en.pdf [date of access: 15.05.2023].

23. Food and Drug Administration. Guidance for industry. bioanalytical method validation. 2018. URL: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidancefor-Industry.pdf [date of access: 15.05.2023].

24. Руководство по экспертизе лекарственных средств. М.: Полиграф-Плюс; 2014; (1). [Guide to the expert analysis of drugs. Moscow: Polygraph-Plus; 2014; (1). (In Russ.)].

25. Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза: Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. № 85. 2016. URL: http://docs.cntd.ru/document/456026107 [дата доступа: 15.05.2023].