Биомеханические свойства модели кератоконуса – клеточной культуры роговичных фиброцитов, выращенных в условиях деплетирования по цинку

Обоснование. Изучение этиопатогенеза такого заболевания роговицы, как  кератоконус, существенно затруднено в  связи с  невозможностью исследования лежащих в  его  основе ультраструктурных и  молекулярных изменений роговицы на пациентах in vivo и на животных моделях.

Цель исследования. Оценка влияния деплетирования среды ионами цинка на структуру и биомеханические свойства стромы роговицы in vitro на примере клеточной модели роговичных фиброцитов.

Материал и методы. В процессе настоящего экспериментального исследования были использованы клеточные модели стромы роговицы в «норме» и при кератоконусе – трёхмерные тканеинженерные конструкции на основе роговичных фибробластов, полученных из кератоцитов здоровых доноров, выращенных на  стандартной и  обеднённой ионами цинка питательных средах соответственно. Оценку биомеханических свойств тканеинженерных конструкций, моделирующих «здоровую» и «кератоконусную» строму роговицы, производили методом наноиндентирования при помощи атомно-силового микроскопа. Дополнительно проводили гистологическую оценку полученных клеточных пластов и иммуногистохимический анализ коллагена I типа.

Результаты. По итогам исследования пяти образцов каждой из моделей стромы роговицы было установлено статистически значимое различие биомеханических свойств: эффективный модуль Юнга «здоровой» и «кератоконусной» моделей составил 9,9  [5,4;  15.6] и  10,3  [6,1;  14,8]  кПа соответственно. Толщина пластов в «здоровой» группе составила 17,67 ± 1,32 и 18,10 ± 1,22 мкм на сроке 2 и 4 недели культивирования соответственно; в «кератоконусной» группе на деплетированной по цинку среде толщина пластов составила 21,25 ± 8,39 и 25,55 ± 5,67 мкм на тех же сроках культивирования соответственно. В структуре последних превалирует экстраклеточный компонент с избыточной коллагеновой фракцией.

Заключение. Полученные по итогам экспериментальной работы данные подтверждают современную концепцию этиопатогенеза кератоконуса, согласно которой нарушения биомеханической функции роговицы при этом заболевании являются следствием минерального дисметаболизма ионов меди, железа и цинка в её соединительнотканной строме.

1. Аветисов С.Э., Новиков И.А., Патеюк Л.С. Кератоконус: этиологические факторы и сопутствующие проявления. Вестник офтальмологии. 2014; 130(4): 110-116.

2. Панес М.А., Позняк С.Н. Кератоконус (обзор литературы). Офтальмология. Восточная Европа. 2014; 2(21): 54-64.

3. Фабрикантов О.Л., Манаенкова Г.Е. Этиология, патогенез, клиника, классификация, лечение кератоконуса (обзор литературы). Сибирский научный медицинский журнал. 2017; 4(37): 64-71.

4. Терещенко А.В., Демьянченко С.К., Тимофеев М.А. Кератоконус (обзор). Саратовский научно-медицинский журнал. 2020; 16(1): 293-297.

5. Аветисов С.Э., Мамиконян В.Р., Новиков И.А., Патеюк Л.С., Осипян Г.А., Кирющенкова Н.П. Перераспределение минеральных элементов в роговице при кератоконусе. Вестник офтальмологии. 2015; 131(6): 34-42. doi: 10.17116/oftalma2015131634-42

6. Суббот А.М., Новиков И.А., Патеюк Л.С., Кобзева А.В., Аветисов С.Э. Клеточная модель для экспериментального изучения патогенеза кератоконуса. Гены и клетки. 2023; 18(1): 69-77. doi: 10.23868/gc321383

7. Халисов М.М. Применение атомно-силовой микроскопии для детектирования отклика нативных клеток на внешние воздействия. СПб.; 2018.

8. Efremov YuM, Shpichka AI, Kotova SL, Timashev PS. Viscoelastic mapping of cells based on fast force volume and PeakForce Tapping. Soft Matter. 2019; 15: 5455-5463. doi: 10.1039/C9SM00711C

9. Shiju TM, Carlos de Oliveira R, Wilson SE. 3D in vitro corneal models: A review of current technologies. Exp Eye Res. 2020; 200: 108213. doi: 10.1016/j.exer.2020.108213

10. Rönkkö S, Vellonen KS, Järvinen K, Toropainen E, Urtti A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Deliv Transl Res. 2016; 6(6): 660-675. doi: 10.1007/s13346-016-0330-y

11. Reichl S. Cell culture models of the human cornea – A comparative evaluation of their usefulness to determine ocular drug absorption in vitro. J Pharm Pharmacol. 2008; 60(3): 299-307. doi: 10.1211/jpp.60.3.0004

12. García-Posadas L, Diebold Y. Three-dimensional human cell culture models to study the pathophysiology of the anterior eye. Pharmaceutics. 2020; 12(12): 1215. doi: 10.3390/pharmaceutics12121215

13. Joseph R, Srivastava OP, Pfister RR. Downregulation of β-actin gene and human antigen R in human keratoconus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012; 53(7): 4032-4041. doi: 10.1167/iovs.11-9062

14. Joseph R, Srivastava OP, Pfister RR. Modeling keratoconus using induced pluripotent stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2016; 57(8): 3685-3697. doi: 10.1167/iovs.16-19105

15. Joseph R, Srivastava OP, Pfister RR. Downregulation of β-actin and its regulatory gene HuR affect cell migration of human corneal fibroblasts. Mol Vis. 2014; 20: 593-605.

16. Karamichos D, Zareian R, Guo X, Hutcheon AEK, Ruberti JW, Zieske JD. Novel in vitro model for keratoconus disease. J Funct Biomater. 2012; 3(4): 760-775. doi: 10.3390/jfb3040760

17. Foster J, Wu WH, Scott SG, Bassi M, Mohan D, Daoud Y, et al. Transforming growth factor β and insulin signal changes in stromal fibroblasts of individual keratoconus patients. PLoS One. 2014; 9(9): e106556. doi: 10.1371/journal.pone.0106556

18. Last JA, Thomasy SM, Croasdale CR, Russell P, Murphy CJ. Compliance profile of the human cornea as measured by atomic force microscopy. Micron. 2012; 43(12): 1293-1298. doi: 10.1016/j.micron.2012.02.014