Разработка ОТ-рвПЦР для оценки экспрессии генов «домашнего хозяйства» ACTB и SDHA в культурах клеток млекопитающих-хозяев зоонозных инфекций

Обоснование. Исследования экспрессии генов в клетках животных-хозяев зоонозных инфекций необходимы для понимания механизмов взаимодействия патогена и хозяина и способов существования патогенов в природе. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-рвПЦР) – один из наиболее надёжных и доступных современных методов сравнительного изучения экспрессии генов, поэтому подбор эндогенных стандартов (референтных генов) для нормализации результатов ПЦР является необходимым этапом исследования.
Цель исследования. Разработка ОТ-рвПЦР для выявления транскриптов (матричной РНК (мРНК)) генов субъединицы А сукцинатдегидрогеназы (SDHA) и бета-актина (ACTB) в культурах клеток млекопитающих – хозяев зоонозных инфекций.
Методы. Культуры клеток почки восточноазиатской лесной мыши ApnK и почки эмбриона свиньи СПЭВ выращивали в 24-луночных планшетах. Монослои клеток открепляли трипсином и выделяли суммарную РНК/ДНК. Геномную ДНК удаляли ДНКазой I, свободной от РНКаз. Далее проводили одностадийную ОТ-рвПЦР с использованием разработанных наборов праймеров и соответствующих гидролизуемых зондов TaqMan к SDHA и ACTB. Эксперимент проводили в четырёх независимых воспроизведениях.
Результаты. При детекции мРНК гена ACTB в обеих культурах клеток и гена SDHA в культуре СПЭВ линейность, эффективность, повторяемость и воспроизводимость теста соответствуют современным требованиям к ОТ-рвПЦР. Детекция мРНК SDHA в клетках ApnK отвечает требованиям к линейности и эффективности реакции, однако повторяемость (CV = 2,7 %) и воспроизводимость (CV = 5,8 %) теста несколько превышают рекомендуемые пределы. Для использования этого гена в качестве референтного требуется исследовать особенности экспрессии SDHA в клетках ApnK.
Заключение. Разработана методика ОТ-рвПЦР для оценки экспрессии генов «домашнего хозяйства» ACTB и SDHA в клетках восточноазиатской лесной мыши (A. peninsulae) и свиньи (S. scrofa). На следующем этапе исследования необходимо валидировать эти гены в качестве референтных для количественной оценки экспрессии генов млекопитающих-хозяев зоонозных инфекций в норме и при патологии.

1. FAO, UNEP, WHO, and WOAH. One Health Joint Plan of Action (2022–2026). Working together for the health of humans, animals, plants and the environment. Rome; 2022. doi: 10.4060/cc2289en

2. Plourde BT, Burgess TL, Eskew EA, Roth TM, Stephenson N, Foley JE. Are disease reservoirs special? Taxonomic and life history characteristics. PLoS One. 2017; 12(7): e0180716. doi: 10.1371/journal.pone.0180716

3. Donoso MO, Karan LS, Růžek D. Tick-borne encephalitis viruses: A general overview. In: Flavivirus encephalitis. 2011: 133-156. doi: 10.5772/21912

4. Halouani A, Jmii H, Michaux H, Renard C, Martens H, Pirottin D, et al. Housekeeping gene expression in the fetal and neonatal murine thymus following coxsackievirus B4 infection. Genes (Basel). 2020; 11(3): 279. doi: 10.3390/genes11030279

5. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009; 55(4): 611-622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797

6. De Spiegelaere W, Dern-Wieloch J, Weigel R, Schumacher V, Schorle H, Nettersheim D, et al. Reference gene validation for RT-qPCR, a note on different available software packages. PLoS One. 2015; 10(3): e0122515. doi: 10.1371/journal.pone.0122515

7. Panina Y, Germond A, Masui S, Watanabe TM. Validation of common housekeeping genes as reference for qPCR gene expression analysis during iPS reprogramming process. Sci Rep. 2018; 8(1): 8716. doi: 10.1038/s41598-018-26707-8

8. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002; 3(7): RESEARCH0034. doi: 10.1186/gb-2002-3-7-research0034

9. Хаснатинов М.А., Болотова Н.А., Миловидов К.С., Данчинова Г.А., Кондратов И.Г. Репликация РНК вируса клещевого энцефалита в новой перевиваемой линии клеток естественного хозяина Apodemus peninsulae. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018; 36(1): 41-45.

10. Chapman JR, Waldenström J. With reference to reference genes: A systematic review of endogenous controls in gene expression studies. PLoS One. 2015; 10(11): e0141853. doi: 10.1371/journal.pone.0141853

11. Adeola F. Normalization of gene expression by quantitative RT-PCR in human cell line: comparison of 12 endogenous reference genes. Ethiop J Health Sci. 2018; 28(6): 741-748. doi: 10.4314/ejhs.v28i6.9

12. Gu Y, Tang S, Wang Z, Cai L, Lian H, Shen Y, et al. A pancancer analysis of the prognostic and immunological role of β-actin (ACTB) in human cancers. Bioengineered. 2021; 12(1): 6166-6185. doi: 10.1080/21655979.2021.1973220

13. Higuera A, Muñoz M, López MC, Reyes P, Urbano P, Villalobos O, et al. Succinate dehydrogenase gene as a marker for studying Blastocystis genetic diversity. Heliyon. 2020; 6(11): e05387. doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e05387