Выделение и полногеномное секвенирование липофильной анаэробной бактерии, представителя видового комплекса Corynebacterium tuberculostearicum, из туберкулёзного очага

Обоснование. Исследование микробиома нижних дыхательных путей активно развивается последние несколько лет за счёт применения методов полногеномного секвенирования (WGS, whole genome sequencing). Благодаря этому стало понятно, что природа микробиоты лёгких сильно отличается от других микробных сообществ, населяющих тело человека. Одним из важных направлений исследования патологических биоценозов в лёгких является изучение роли сателлитной микробиоты туберкулёзного очага.

Цель работы. Выделение и характеристика толерантных к кислороду анаэробов из некротического содержимого туберкулом.

Материалы и методы. Биопсийный материал от 5 больных туберкулёзом лёгких был получен в процессе плановой операции по иссечению туберкулом. Из одного образца при анаэробном культивировании была выделена чистая культура. Липазную активность штамма определяли посевом на сердечномозговой агар (HIMEDIA, Индия) с добавлением 0,1 % Tween-80 и 10 мМ CaCl₂. Чувствительность к антибиотикам определялась в RAPMYCO и SLOWMYCO TREK Diagnostic Systems (Thermo Fisher Scientific, США). ДНК из осадка бульонной культуры выделяли CTAB-хлороформным методом. Полногеномное секвенирование осуществлено на NGS-секвенаторе DNBSeq-G400 компанией «Геномед» (Россия).

Результаты. По результатам WGS и по данным филогенетического анализа штамм был идентифицирован как Corynebacterium kefirresidentii. Штамм характеризовался высокой липазной активностью и устойчивостью только к изониазиду, этионамиду и триметоприму/сульфаметоксазолу.

Заключение. Выделение из туберкулёзного очага липофильного анаэробного представителя видового комплекса Corynebacterium tuberculostearicum свидетельствует о возможной роли нетуберкулёзной микробиоты в  процессах разжижения казеозного некроза. Нами выдвигается гипотеза о том, что внутри туберкулёзного очага в некоторых случаях создаются благоприятные условия для развития вторичной анаэробной липофильной микробиоты.

1. Natalini JG, Singh S, Segal LN. The dynamic lung microbiome in health and disease. Nat Rev Microbiol. 2023; 21: 222-235. doi: 10.1038/s41579-022-00821-x

2. Man W, de Steenhuijsen Piters W, Bogaert D. The microbiota of the respiratory tract: Gatekeeper to respiratory health. Nat Rev Microbiol. 2017; 15: 259-270. doi: 10.1038/nrmicro.2017.14

3. Remot A, Descamps D, Noordine ML, Boukadiri A, Mathieu E, Robert V, et al. Bacteria isolated from lung modulate asthma susceptibility in mice. ISME J. 2017; 11(5): 1061-1074. doi: 10.1038/ismej.2016.181

4. Hilty M, Burke C, Pedro H, Cardenas P, Bush A, Bossley C, et al. Disordered microbial communities in asthmatic airways. PLoS One. 2010; 5(1): e8578. doi: 10.1371/journal.pone.0008578

5. Guarner F, Malagelada JR. Gut flora in health and disease. Lancet. 2003; 361(9356): 512-519. doi: 10.1016/S0140-6736(03)12489-0

6. de Steenhuijsen Piters WAA, Binkowska J, Bogaert D. Early life microbiota and respiratory tract infections. Cell Host Microbe. 2020; 12; 28(2): 223-232. doi: 10.1016/j.chom.2020.07.004

7. Orlova EA, Ogarkov OB, Suzdalnitskiy AE, Khromova PA, Sinkov VV, Plotnikov AO, et al. Analysis of microbial diversity in caseous necrosis of tuberculosis foci. Mol Genet Microbiol Virol. 2021; (36): 132-138. doi: 10.3103/S0891416821030058

8. Огарков О.Б., Суздальницкий А.Е., Хромова П.А., Цыренова Т.А., Сокольникова Н.А., Жданова С.Н., и др. Продукция биофильмов клиническими штаммами возбудителя туберкулеза. Инфекция и иммунитет. 2018; 8(4): 435-440. doi: 10.15789/2220-7619-2018-4-435-440

9. Ogarkov OB, Badleeva V, Belkova NL, Adelshin RV, Tsyrenova TA, Khromova PA, et al. The phenomenon of the formation of biofilms by Brevibacillus spp. and Bacillus spp. in the presence of clinical strains of Mycobacterium tuberculosis. Mol Genet Microbiol Virol. 2017; (32): 148-154. doi: 10.3103/S0891416817030065

10. Cronan MR. In the thick of it: Formation of the tuberculous granuloma and its effects on host and therapeutic responses. Front Immunol. 2022; 7(13): 820134. doi: 10.3389/fimmu.2022.820134

11. Холодок О.А., Григоренко А.А., Черемкин М.И. Туберкулема легкого как форма туберкулезного процесса. Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2014; (53): 126-131.

12. Russell DG, Cardona PJ, Kim MJ, Allain S, Altare F. Foamy macrophages and the progression of the human tuberculosis granuloma. Nat Immunol. 2009; 10(9): 943-948. doi: 10.1038/ni.1781

13. Brown-Elliott BA, Woods GL. Antimycobacterial susceptibility testing of nontuberculous mycobacteria. J Clin Microbiol. 2019; 57(10): e00834-19. doi: 10.1128/JCM.00834-19

14. Медведева Т.В., Огарков О.Б., Некипелов О.М., Ушаков И.В., Козьякова Е.С., Скворцова Р.Г. MIRU-VNTRгенотипирование штаммов Mycobacterium tuberculosis в Восточной Сибири: семейство Beijing против Kilimanjaro. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2004; (4): 33-38.

15. Prjibelski A, Antipov D, Meleshko D, Lapidus A, Korobeynikov A. Using SPAdes de novo assembler. Curr Prot Bioinform. 2020; 70(1): e102. doi: 10.1002/cpbi.102

16. Tamames J, Puente-Sánchez F. SqueezeMeta, a highly portable, fully automatic metagenomic analysis pipeline. Front Microbiol. 2019; 9: 3349. doi: 10.3389/fmicb.2018.03349

17. Meier-Kolthoff JP, Auch AF, Klenk HP, Göker M. Genome sequence-based species delimitation with confidence intervals and improved distance functions. BMC Bioinformatics. 2013; 14: 1-14. doi: 10.1186/1471-2105-14-60

18. Katoh K, Standley DM. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: Improvements in performance and usability. Mol Biol Evol. 2013; 30(4): 772-780. doi: 10.1093/molbev/mst010

19. Minh BQ, Schmidt HA, Chernomor O, Schrempf D, Woodhams MD, von Haeseler A, et al. IQ-TREE 2: New models and efficient methods for phylogenetic inference in the genomic era. Mol Biol Evol. 2020; 37(5): 1530-1534. doi: 10.1093/molbev/msaa015

20. Edgar RC. Updating the 97 % identity threshold for 16S ribosomal RNA OTUs. Bioinformatics. 2018; 34(14): 2371-2375. doi: 10.1093/bioinformatics/bty113

21. Boxberger M, Antezack A, Magnien S, Cassir N, La Scola B. Complete genome and description of Corynebacterium incognita sp. nov.: A new bacterium within the Corynebacterium genus. New Microbes New Infect. 2021; 42: 100893. doi: 10.1016/j.nmni.2021.100893

22. Council SE, Savage AM, Urban JM, Ehlers ME, Skene JH, Platt ML, et al. Diversity and evolution of the primate skin microbiome. Proc Biol Sci. 2016; 283(1822): 20152586. doi: 10.1098/rspb.2015.2586

23. Salamzade R, Swaney MH, Kalan LR. Comparative genomic and metagenomic investigations of the Corynebacterium tuberculostearicum species complex reveals potential mechanisms underlying associations to skin health and disease. Microbiol Spectr. 2023; 11(1): e0357822. doi: 10.1128/spectrum.03578-22

24. Dover LG, Thompson AR, Sutcliffe IC, Sangal V. Phylogenomic reappraisal of fatty acid biosynthesis, mycolic acid biosynthesis and clinical relevance among members of the genus Corynebacterium. Front Microbiol. 2021; 12: 802532. doi: 10.3389/fmicb.2021.802532

25. Morlock GP, Metchock B, Sikes D, Crawford JT, Cooksey RC. ethA, inhA, and katG loci of ethionamide-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2003; 47(12): 3799-3805. doi: 10.1128/AAC.47.12.3799-3805.2003