Оптимизация методики количественной ОТ-ПЦР для оценки концентрации геномной +РНК вируса клещевого энцефалита
https://doi.org/10.29413/ABS.2019-4.5.18
Аннотация
Обоснование. Для изучения механизмов репликации вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в клетках позвоночных хозяев разных видов необходимо дифференциальное определение концентрации геномной и репликативной форм РНК (+РНК и –РНК соответственно). Однако имеющиеся в настоящее время подходы рассчитаны на измерение суммарного количества вирусной РНК. Для достоверного определения количества вирусной РНК на разных стадиях репликативного цикла требуется оптимизация методики ОТ-ПЦР.
Цель исследования. Разработать панель стандартных образцов синтетической ВКЭ и оптимизировать ОТ-ПЦР для специфичного количественного определения геномной +РНК вируса.
Методы. Фрагмент геномной +РНК ВКЭ синтезировали с использованием плазмидного вектора pTZ57RT\A со встроенным промотором T7 и соответствующей РНК-полимеразы. Контаминирующую ДНК удаляли с помощью обработки свободной от РНКаз ДНКазой I и дополнительного этапа выделения РНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием специфичного антисмыслового праймера 11154R 5`- AGCGGGTGTTTTTCCG-3`, а количественное определение с помощью ПЦР выполняли согласно M. Schwaiger и P. Cassinotti (2003) с модификациями.
Результаты. В результате амплификации стандартных образцов концентрации РНК ВКЭ положительной полярности, проведённой в пяти независимых повторах в разные дни, коэффициент корреляции R2 между циклом количественного определения и концентрацией стандартного образца составил 0,99, а эффективность ПЦР составила 100%. Характеристики воспроизводимости, линейности и эффективности ПЦР свидетельствуют о валидности определения концентрации РНК ВКЭ. Коэффициент вариации при оценке межтестовой точности определения в среднем составил 2,8%, что сопоставимо с показателями оригинальнй методики.
Заключение. Оптимизированная количественная ОТ-ПЦР позволяет проводить рутинное лабораторное определение количества геномной РНК ВКЭ.
Об авторах
Н. А. Ляпунова
ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»
Россия
Россия
младший научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций
664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия
М. А. Хаснатинов
ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»
Россия
Россия
кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций
64003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия
Г. А. Данчинова
ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»
Россия
Россия
доктор биологических наук, руководитель лаборатории трансмиссивных инфекций
http://orcid.org/0000-0002-6705-3070
664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия
Список литературы
1. Шестопалов Н.В., Шашина Н.И., Германт О.М., Пакскина Н.Д., Царенко В.А., Веригина Е.В., Бойко Л.С. Информационное письмо «Природно-очаговые инфекции, возбудителей которых передают иксодовые клещи, и их неспецифическая профилактика в российской федерации (по состоянию на 01.01.2019 г.)». Дезинфекционное дело. 2019; 1(107): 37-44.
2. Ecker M, Allison SL, Meixner T, Heinz FX. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. J Gen Virol. 1999; 80: 179-185. doi: 10.1099/0022-1317-80-1-179
3. Козлова И.В., Демина Т.В., Ткачев С.Е., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Верхозина М.М., и др. Характеристика байкальского субтипа вируса клещевого энцефалита, циркулирующего на территории Восточной Сибири. Acta biomedica scientifica. 2018; 3(4): 53-60. doi: 10.29413/ABS.2018-3.4.9
4. Dai X, Shang G, Lu S, Yang J, Xu J. A new subtype of eastern tick-borne encephalitis virus discovered in Qinghai-Tibet Plateau, China. Emerg Microbes Infect. 2018; 7(1): 74. doi: 10.1038/s41426-018-0081-6
5. Wallner G, Mandl CW, Kunz C, Heinz FX. The flavivirus 3’-noncoding region: extensive size heterogeneity independent of evolutionary relationships among strains of tick-borne encephalitis virus. Virology. 1995; 213(1): 169-178. doi: 10.1006/viro.1995.1557
6. Mandl CW, Kunz C, Heinz FX. Presence of poly(A) in a flavivirus: significant differences between the 3’-noncoding regions of the genomic RNAs of tick-borne encephalitis virus strains. J Virol. 1991; 65(8): 4070-4077.
7. Wallner G, Mandl CW, Ecker M, Holzmann H, Stiasny K, Kunz C, Heinz FX. Characterization and complete genome sequences of high- and low-virulence variants of tick-borne encephalitis virus. J Gen Virol. 1996; 77: 1035-1042. doi: 10.1099/0022-1317-77-5-1035
8. Chu PW, Westaway EG. Replication strategy of Kunjin virus: evidence for recycling role of replicative form RNA as template in semiconservative and asymmetric replication. Virology. 1985; 140(1): 68-79. doi: 10.1016/0042-6822(85)90446-5
9. Lindenbach BD, Thiel H-J, Rice CM. Flaviviridae: the viruses and their replication. In: Knipe DM, Howley PM (eds.). Fields Virology, 5th Edition. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia; 2007; 1101-1152.
10. Иткес А.В. Полимеразная цепная реакция. М.: Альтекс; 1999.
11. Пальцев М.А. Введение в молекулярную медицину. М.: Медицина; 2004.
12. Carnegie PR. Quality control in the food industries with DNA technologies. Australas Biotechnol. 1994; 4(3): 146-149.
13. De Vega М, Blanco L, Salas M. Processive proofreading and the spatial relationship between polymerase and exonuclease active sites of bacteriophage ø29 DNA polymerase. J Mol Biol. 1999; 292(1): 39-51. doi: 10.1006/jmbi.1999.3052
14. Dean FB, Neison JR, Giesier TL, Lasken RS. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi29 DNA polymerase and multiplyprimed rolling circle amplification. Genome Res. 2001; 11(6): 1095-1099. doi: 10.1101/gr.180501
15. Lo АС, Feldman SR. Polymerase chain reaction: basic concepts and clinical applications in dermatology. J Am Acad Dermatol. 1994; 30(2 Pt 1): 250-260. doi: 10.1016/S0190-9622(94)70025-7
16. Little MC, Andrews J, Moore R, Bustos S, Jones L, Embres C, et al. Strand displacement amplification and homogeneous real-time detection incorporated in a second-generation DNA probe system, BDProbeTecET. Clin Chem. 1999; 45(6): 777-784.
17. Schwaiger M, Cassinotti P. Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA. J Clin Virol. 2003; 27(2): 136-145. doi: 10.1016/S1386-6532(02)00168-3
18. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г., Рюмин Д.В. Полимеразная цепная реакция в реальном времени. М.: ЦНИИ Эпидемиологии РФ; 2004. URL: http://www.interlabservice.ru/catalog/faq/?id=3422.
19. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real-time quantitative PCR. Genome Res. 1996; 6(10): 986-994. doi: 10.1101/gr.6.10.986
20. Хаснатинов М.А., Болотова Н.А., Миловидов К.С., Кондратов И.Г., Данчинова Г.А. Репликация РНК вируса клещевого энцефалита в новой перевиваемой линии клеток естественного хозяина Apodemus peninsulae. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018; 36(1): 41-45. doi: 10.18821/0208-0613-2018-36-1-41-45
21. Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Злобин В.И., Ляпунов А.В., Арбатская Е.В., Чапоргина Е.А., и др. Вирус клещевого энцефалита в Монголии. Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2012; 4: 9-12.
22. Chung CT, Niemela SI, Miller RH. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS. 1998; 86(7): 2172-2175. doi: 10.1073/pnas.86.7.2172
23. Walpole RE, Myers RH, Myers SL, Ye K. Probability & Statistics for Engineers & Scientists, 8th ed. Upper Saddle River: Pearson Education, Inc.; 2007.
Рецензия
Для цитирования:
Ляпунова Н.А., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А. Оптимизация методики количественной ОТ-ПЦР для оценки концентрации геномной +РНК вируса клещевого энцефалита. Acta Biomedica Scientifica. 2019;4(5):116-121. https://doi.org/10.29413/ABS.2019-4.5.18
For citation:
Liapunovа N.A., Khasnatinov M.A., Danchinova G.A. Optimization of a Quantitative Real-Time RT-PCR Technique for Evaluation of Concentration of Genomic +RNA of Tick-Borne Encephalitis Virus. Acta Biomedica Scientifica. 2019;4(5):116-121. (In Russ.) https://doi.org/10.29413/ABS.2019-4.5.18
Просмотров: 580
Послать статью по эл. почте 
