actabiomedicaActa Biomedica ScientificaActa Biomedica Scientifica2541-94202587-9596Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems10.29413/ABS.2018-3.5.5actabiomedica-704Research ArticleГЕНЕТИКА, ПРОТЕОМИКА И МЕТАБОЛОМИКАGENETICS, PROTEOMICS AND METABOLOMICSБИОИНФОРМАЦИОННЫЙ ПОИСК СТРУКТУР CRISPR/CAS-СИСТЕМЫ В ГЕНОМЕ ПЛАЗМИДЫ PCT281 ШТАММА BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP. CHINENSIS CT-43BIOINFORMATIC SEARCH OF CRISPR/CAS SYSTEM STRUCTURES IN GENOME OF PCT281 PLASMID OF BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP. CHINENSIS STRAIN CT-43АрефьеваН. А.ArefyevaN. A.

664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1.

студентка 3-го курса кафедры физико-химической биологии биолого-почвенногофакультета.

ul. Karla Marksa 1, Irkutsk 664003.

3rd year student at the Department of Physiochemical Biology of the Faculty of Biology and Soil Science.

arefieva.n4@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-5410-5113ДжиоевЮ. П.DzhioevYu. P.

664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1.

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией молекулярной вирусологии и биотехнологии НИИ биомедицинских технологий.

ul. Krasnogo Vosstaniya 1, Irkutsk 664003.

Candidate of Biological Sciences, Leading Research Officer, Head of the Laboratory of Molecular Virology and Biotechnology, Research Institute of Biomedical Technologies.

alanir07@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6094-5864БорисенкоА. Ю.BorisenkoA. Yu.

664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1.

 аспирант, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.

ul. Krasnogo Vosstaniya 1, Irkutsk 664003.

Postgraduate, Teaching Assistant at the Department of Microbiology, Virology and Immunology.

89500720225@mail.ruЧемериловаВ. И.ChemerilovaV. I.

664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1.

кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета.

ul. Karla Marksa 1, Irkutsk 664003.

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Microbiology of the Faculty of Biology and Soil Science.

valchem@yandex.ruВятчинаО. Ф.VyatchinaO. F.

664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1.

кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета.

ul. Karla Marksa 1, Irkutsk 664003.

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Microbiology of the Faculty of Biology and Soil Science.

olgairk3@rambler.ruСекеринаО. А.SekerinaO. A.

664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1.

кандидат биологических наук, доцент кафедры медицинской биологии медико-профилактического факультета.

ul. Krasnogo Vosstaniya 1, Irkutsk 664003.

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Medical Biology of the Public Health Faculty.

o.sekerina@ismu.baikal.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5792-7283СтепаненкоЛ. А.StepanenkoL. A.

664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1.

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии и биотехнологии НИИ биомедицинских технологий.

ul. Krasnogo Vosstaniya 1, Irkutsk 664003.

Candidate of Medical Sciences, Senior Research Officer at the Laboratory of Molecular Virology and Biotechnology, Research Institute of Biomedical Technologies.

steplia@mail.ruМарковаЮ. А.MarkovaYu. A.

664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132.

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, заведующая лабораторией растительно-микробных взаимодействий.

ul. Lermontova 132, Irkutsk 664033.

Doctor of Biological Sciences, Senior Research Officer, Head of the Laboratory of Plant Microbial Interactions.

juliam06@mail.ruЮриноваГ. В.YurinovaG. V.

664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1.

кандидат биологических наук, доцент кафедры физико-химической биологии биологопочвенного факультета.

ul. Karla Marksa 1, Irkutsk 664003.

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Physicochemical Biology of the Faculty of Biology and Soil Science.

yurinova@yandex.ruСаловароваВ. П.SalovarovaV. P.

664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1.

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой физико-химической биологии биолого-почвенного факультета.

ul. Karla Marksa 1, Irkutsk 664003.

Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Department of Physicochemical Biology of the Faculty of Biology and Soil Science.

vsalovarova@rambler.ruПриставкаА. А.PristavkaA. A.

664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1.

кандидат биологических наук, доцент кафедры физико-химической биологии биолого-почвенного факультета.

ul. Karla Marksa 1, Irkutsk 664003.

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Physicochemical Biology of the Faculty of Biology and Soil Science.

pristavk@gmail.comКузьминоваВ. А.KuzminovaV. A.

664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1.

студентка 3-го курса кафедры физико-химической биологии биолого-почвенного факультета.

ul. Karla Marksa 1, Irkutsk 664003.

3rd year student at the Department of Physicochemical Biology of the Faculty of Biology and Soil Science.

ewwwrye@gmail.comРеваО. Н.RevaO. N.

Pretoria 0002, Private Bag X20, Hatfield, 0028.

кандидат биологических наук, доцент.

Pretoria 0002, Private Bag X20, Hatfield, 0028.

PhD in Biology, Associate Professor.

reva@mail.ruЗлобинВ. И.ZlobinV. I.

664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1.

доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, директор НИИ биомедицинских технологий.

ul. Krasnogo Vosstaniya 1, Irkutsk 664003.

Doctor of Medical Sciences, Professor, Academician of RAS, Head of the Department of Microbiology, Virology and Immunology, Director of the Research Institute of Biomedical Technologies.

vizlobin@mail.ruФГБОУ ВО «Иркутский государственный университет».Irkutsk State University.ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России.Irkutsk State Medical University.ФГБУН «Сибирский институт физиологии и биохимии растений» СО РАН.Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS.Центр биоинформатики и компьютерной биологии, Кафедра биохимии, генетики и микробиологии, Университет Претории.Centre for Bioinformatics and Computational Biology, Department of Biochemistry, Genetics and Microbiology, University of Pretoria.201828092018353338Copyright © Арефьева Н.А., Джиоев Ю.П., Борисенко А.Ю., Чемерилова В.И., Вятчина О.Ф., Секерина О.А., Степаненко Л.А., Маркова Ю.А., Юринова Г.В., Саловарова В.П., Приставка А.А., Кузьминова В.А., Рева О.Н., Злобин В.И., 20182018Арефьева Н.А., Джиоев Ю.П., Борисенко А.Ю., Чемерилова В.И., Вятчина О.Ф., Секерина О.А., Степаненко Л.А., Маркова Ю.А., Юринова Г.В., Саловарова В.П., Приставка А.А., Кузьминова В.А., Рева О.Н., Злобин В.И.Arefyeva N.A., Dzhioev Y.P., Borisenko A.Y., Chemerilova V.I., Vyatchina O.F., Sekerina O.A., Stepanenko L.A., Markova Y.A., Yurinova G.V., Salovarova V.P., Pristavka A.A., Kuzminova V.A., Reva O.N., Zlobin V.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.actabiomedica.ru/jour/article/view/704Введение

Введение. Современные методы биоинформатики позволяют проводить поиск и анализ функционально важных участков в геноме. Одними из таких участков в геноме бактерий являются локусы CRISPR/Casсистем, выполняющих роль «адаптивной иммунной защиты» от чужеродных нуклеиновых кислот. Поиск и анализ структур CRISPR/Cas-систем в геномах плазмид и фагов предоставляет новую информацию об эволюции данных систем в бактериальных хозяевах.

Цель исследования

Цель исследования: поиск структур CRISPR/Cas-систем в геноме плазмиды pCT281 штамма Bacillus thuringiensis subsp. chinensis CT-43 при помощи методов биоинформатики.

Материалы и методы

Материалы и методы. Материалом для исследования являлся геном плазмиды pCT281 штаммаB. thuringiensis subsp. chinensis CT-43, загруженный из базы данных RefSeq. Для идентификации cas-генов была использована программа MacSyFinder (ver. 1.0.5). Детекция CRISPR-кассет проводилась при помощи трёх приложений: CRISPRFinder, PILER-CR, CRISPR Recognition Tool (CRT). Консенсусная структура повторов получена в WebLogo 3.

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. В плазмиде pCT281 был выявлен один локус CRISPR/Cas-системы типа I-C. В данном локусе были идентифицированы две CRISRP-кассеты, между которыми расположена последовательность из четырёх cas-генов. В первой CRISPR-кассете зафиксированы последовательности 10 спейсеров размером от 32 до 35 пар нуклеотидов (п. н.) и 11 повторов (32 п. н.). Во второй CRISPR-кассете обнаружены последовательности 5 спейсеров (33–53 п. н.), разделённых шестью повторами по 32 п. н.

Выводы

Выводы. Используемые биоинформационные методы позволяют эффективно проводить поиск структур CRISPR/Cas-системы в мобильных элементах генома. Наличие CRISPR-кассет и cas-генов в плазмиде pCT281 может свидетельствовать о возможной передаче CRISPR/Cas-системы от бактериальной хромосомы данной плазмиде. Выявленные спейсерные последовательности CRISPR-кассет предоставляют информацию о фагах, с которыми данная бактерия встречалась.

Background

Background. CRISPR/Cas systems loci are one of the functionally important patterns in bacterial genome which perform the role of “adaptive immune defense” from foreign nucleic acids. The study of CRISPR/Cas systems structure in genomes of plasmids and phages provide new information about the evolution of this systems in bacterial hosts.

Aims

Aims. A search of CRISPR/Cas systems structures in pCT281 plasmid from Bacillus thuringiensis subsp. chinensis strain CT-43 using bioinformatic methods.

Materials and methods

Materials and methods. Search studies using bioinformatics methods were performed with the genome of pCT281 plasmid of B. thuringiensis subsp. chinensis strain CT-43 from the RefSeq database. To search for the CRISPR/Cas system structure MacSyFinder (ver. 1.0.5) and three combined algorithms were used: CRISPRFinder; PILER-CR; CRISPR Recognition Tool (CRT). The consensus repeat sequence was generated in WebLogo 3.

Results and discussion

Results and discussion. In pCT281 plasmid we detected one locus of CRISPR/Cas system of the type I-C which contains 2 CRISPR-cassettes and 4 cas-genes located between them. The CRISPR-cassette 1 includes 10 spacers from 32 to 35 bp and 11 repeats 32bp in length. 5 spacers (33–35 bp) separated by 6 repeats 32 bp in length were detected in the CRISPR-cassette 2.

Conclusions

Conclusions. The bioinformatic methods used in this study enable to conduct a search of CRISPR/Cas systems structures in plasmid genomes. The presence of the CRISPR-Cas locus in pCT281 plasmid confirms a possible transfer of this system from the nucleoid to this plasmid. The detected spacers provide information about phages this bacteria was encountered.

плазмида pCT281методы биоинформатикиCRISPR/Cas-системаBacillus thuringiensis subsp. chinensis CT-43ReferencesПеретолчина Н.П., Джиоев Ю.П., Борисенко А.Ю., Воскресенская Е.А., Парамонов А.И., Степаненко Л.А., Колбасеева О.В., Злобин В.И. Биоинформационный анализ CRISPR/Cas системы штамма Yersinia pseudotuberculosis IP32953 // Acta biomedica scientifica. – 2016. – № 5. – С. 64–68.Peretolchina NP, Dzhioev YuP, Borisenko AYu, Voskresenskaya EA, Paramonov AI, Stepanenko LA, Kolbaseeva OV, Zlobin VI. ( 2016). Bioinformatics analysis of Yersinia pseudotuberculosis IP32953 CRISPR/Cas system. Acta biomedica scientifica, (5), 64-68.Abby SS, Neron B, Menager H, Touchon M, Rocha EPC. (2014). MacSyFinder: A program to mine genomes for molecular systems with an application to CRISPR-Cas systems. PLoS One, 9 (10), 110726. DOI: 10.1371/journal.pone.0110726.Abby SS, Neron B, Menager H, Touchon M, Rocha EPC. (2014). MacSyFinder: A program to mine genomes for molecular systems with an application to CRISPR-Cas systems. PLoS One, 9 (10), 110726. DOI: 10.1371/journal.pone.0110726.Bland C, Ramsey TL, Sabree F, Lowe M, Brown K, Kyrpides NC, Hugenholtz P. (2007). CRISPR recognition tool (CRT): a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats. BMC Bioinformatics, 8 (209), 1-8. DOI: 10.1186/1471-2105-8-209.Bland C, Ramsey TL, Sabree F, Lowe M, Brown K, Kyrpides NC, Hugenholtz P. (2007). CRISPR recognition tool (CRT): a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats. BMC Bioinformatics, 8 (209), 1-8. DOI: 10.1186/1471-2105-8-209.Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD. (2005). Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology, 151, 2551-2561. DOI: 10.1099/mic.0.28048-0.Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD. (2005). Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology, 151, 2551-2561. DOI: 10.1099/mic.0.28048-0.Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. (2004). WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res, 14 (6), 1188-1190. DOI: 10.1101/gr.849004.Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. (2004). WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res, 14 (6), 1188-1190. DOI: 10.1101/gr.849004.Edgar RC. (2007). PILER-CR: Fast and accurate identification of CRISPR repeats. BMC Bioinformatics, 8 (18), 1-6. DOI: 10.1186/1471-2105-8-18.Edgar RC. (2007). PILER-CR: Fast and accurate identification of CRISPR repeats. BMC Bioinformatics, 8 (18), 1-6. DOI: 10.1186/1471-2105-8-18.Fernald GH, Capriotti E, Daneshjou R, Karczewski KJ, Altman RB. (2011). Bioinformatics challenges for personalized medicine. Bioinformatics, 27 (13), 1741-1748. DOI: 10.1093/bioinformatics/btr295.Fernald GH, Capriotti E, Daneshjou R, Karczewski KJ, Altman RB. (2011). Bioinformatics challenges for personalized medicine. Bioinformatics, 27 (13), 1741-1748. DOI: 10.1093/bioinformatics/btr295.Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF. (2013). ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol, 31 (7), 397-405. DOI: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004.Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF. (2013). ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol, 31 (7), 397-405. DOI: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004.Gasiunas G, Sinkunas T, Siksnys V. (2014). Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity. Cell Mol Life Sci, 71 (3), 449-465. DOI: 10.1007/s00018-013-1438-6.Gasiunas G, Sinkunas T, Siksnys V. (2014). Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity. Cell Mol Life Sci, 71 (3), 449-465. DOI: 10.1007/s00018-013-1438-6.Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. (2007). CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Nucleic Acids Research, 35, W52-W57. DOI: 10.1093/nar/gkm360.Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. (2007). CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Nucleic Acids Research, 35, W52-W57. DOI: 10.1093/nar/gkm360.Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. (2007). The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics, 23 (8), 172.Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. (2007). The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics, 23 (8), 172.He J, Wang J, Yin W, Shao X, Zheng H, Li M, Zhao Y, Sun M, Wang S, Yu Z. (2011). Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis subsp. chinensis strain CT-43. J Bacteriol, 193 (13), 3407-3408. DOI: 10.1128/JB.05085-11.He J, Wang J, Yin W, Shao X, Zheng H, Li M, Zhao Y, Sun M, Wang S, Yu Z. (2011). Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis subsp. chinensis strain CT-43. J Bacteriol, 193 (13), 3407-3408. DOI: 10.1128/JB.05085-11.Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, Costa F, Shah SA, Saunders SJ, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Haft DH, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Terns RM, Terns MP, White MF, Yakunin AF, Garrett RA, van der Oost J, Backofen R, Koonin EV. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol, 13 (11), 722-736. DOI: 10.1038/nrmicro3569.Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, Costa F, Shah SA, Saunders SJ, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Haft DH, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Terns RM, Terns MP, White MF, Yakunin AF, Garrett RA, van der Oost J, Backofen R, Koonin EV. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol, 13 (11), 722-736. DOI: 10.1038/nrmicro3569.Moore JH, Asselbergs FW, Williams SM. (2010). Bioinformatics challenges for genome-wide association studies. Bioinformatics, 26 (4), 445-455. DOI: 10.1093/bioinformatics/btp713.Moore JH, Asselbergs FW, Williams SM. (2010). Bioinformatics challenges for genome-wide association studies. Bioinformatics, 26 (4), 445-455. DOI: 10.1093/bioinformatics/btp713.Nam KH, Haitjema C, Liu X, Ding F, Wang H, DeLisa MP, Ke A. (2012). Cas5d protein processes pre-crRNA and assembles into a cascade-like interference complex in subtype I-C/Dvulg CRISPR-Cas system. Structure, 20 (9), 1574-1584. DOI: 10.1016/j.str.2012.06.016.Nam KH, Haitjema C, Liu X, Ding F, Wang H, DeLisa MP, Ke A. (2012). Cas5d protein processes pre-crRNA and assembles into a cascade-like interference complex in subtype I-C/Dvulg CRISPR-Cas system. Structure, 20 (9), 1574-1584. DOI: 10.1016/j.str.2012.06.016.Navas LE, Amadio AF, Ortiz EM, Sauka DH, Benintende GB, Berretta MF, Zandomeni RO. (2017). Complete sequence and organization of pFR260, the Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4 plasmid harboring insecticidal genes. J Mol Microbiol Biotechnol, 27 (1), 43-54. DOI: 10.1159/000451056.Navas LE, Amadio AF, Ortiz EM, Sauka DH, Benintende GB, Berretta MF, Zandomeni RO. (2017). Complete sequence and organization of pFR260, the Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4 plasmid harboring insecticidal genes. J Mol Microbiol Biotechnol, 27 (1), 43-54. DOI: 10.1159/000451056.Pardo-Lopez L, Soberon M, Bravo A. (2013). Bacillus thuringiensis insecticidal three-domain Cry toxins: mode of action, insect resistance and consequences for crop protection. FEMS Microbiol Rev, 37 (1), 3-22. DOI: 10.1111/j.1574-6976.2012.00341.x.Pardo-Lopez L, Soberon M, Bravo A. (2013). Bacillus thuringiensis insecticidal three-domain Cry toxins: mode of action, insect resistance and consequences for crop protection. FEMS Microbiol Rev, 37 (1), 3-22. DOI: 10.1111/j.1574-6976.2012.00341.x.Roh JY, Choi JY, Li MS, Jin BR, Je YH. (2007). Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control. J Microbiol Biotechnol, 17 (4), 547-559.Roh JY, Choi JY, Li MS, Jin BR, Je YH. (2007). Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control. J Microbiol Biotechnol, 17 (4), 547-559.Rousseau C, Gonnet M, Le Romancer M, Nicolas J. (2009). CRISPI: a CRISPR interactive database. Bioinformatics, 25 (24), 3317-3318. DOI: 10.1093/bioinformatics/btp586.Rousseau C, Gonnet M, Le Romancer M, Nicolas J. (2009). CRISPI: a CRISPR interactive database. Bioinformatics, 25 (24), 3317-3318. DOI: 10.1093/bioinformatics/btp586.Van der Oost J, Jore MM, Westra ER, Lundgren M, Brouns SJ. (2009). CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci, 34 (8), 401-407. DOI: 10.1016/j.tibs.2009.05.002Van der Oost J, Jore MM, Westra ER, Lundgren M, Brouns SJ. (2009). CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci, 34 (8), 401-407. DOI: 10.1016/j.tibs.2009.05.002

The authors declare that there are no conflicts of interest present.