Ляпунова Наталья Андреевна – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций
664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16
Natalia A. Liapunovа – Cand. Sc. (Biol.), Research Officer at the Laboratory of Arthropod-Borne Infections
Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003
Хаснатинов Максим Анатольевич – доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций
664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16
Maxim A. Khasnatinov – Dr. Sc. (Biol.), Leading Research Officer at the Laboratory of Arthropod-Borne Infections
Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003
Данчинова Галина Анатольевна – доктор биологических наук, руководитель лаборатории трансмиссивных инфекций
664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16
Galina A. Danchinova – Dr. Sc. (Biol.), Head of the Laboratory of Arthropod-Borne Infections
Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003
Соловаров Иннокентий Сергеевич – кандидат биологических наук, младший научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций
664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16
Innokentii S. Solovarov – Cand. Sc. (Biol.), Junior Research Officer at the Laboratory of Arthropod-Borne Infections
Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003
Обоснование. Исследования экспрессии генов в клетках животных-хозяев зоонозных инфекций необходимы для понимания механизмов взаимодействия патогена и хозяина и способов существования патогенов в природе. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-рвПЦР) – один из наиболее надёжных и доступных современных методов сравнительного изучения экспрессии генов, поэтому подбор эндогенных стандартов (референтных генов) для нормализации результатов ПЦР является необходимым этапом исследования.Цель исследования. Разработка ОТ-рвПЦР для выявления транскриптов (матричной РНК (мРНК)) генов субъединицы А сукцинатдегидрогеназы (SDHA) и бета-актина (ACTB) в культурах клеток млекопитающих – хозяев зоонозных инфекций.Методы. Культуры клеток почки восточноазиатской лесной мыши ApnK и почки эмбриона свиньи СПЭВ выращивали в 24-луночных планшетах. Монослои клеток открепляли трипсином и выделяли суммарную РНК/ДНК. Геномную ДНК удаляли ДНКазой I, свободной от РНКаз. Далее проводили одностадийную ОТ-рвПЦР с использованием разработанных наборов праймеров и соответствующих гидролизуемых зондов TaqMan к SDHA и ACTB. Эксперимент проводили в четырёх независимых воспроизведениях.Результаты. При детекции мРНК гена ACTB в обеих культурах клеток и гена SDHA в культуре СПЭВ линейность, эффективность, повторяемость и воспроизводимость теста соответствуют современным требованиям к ОТ-рвПЦР. Детекция мРНК SDHA в клетках ApnK отвечает требованиям к линейности и эффективности реакции, однако повторяемость (CV = 2,7 %) и воспроизводимость (CV = 5,8 %) теста несколько превышают рекомендуемые пределы. Для использования этого гена в качестве референтного требуется исследовать особенности экспрессии SDHA в клетках ApnK.Заключение. Разработана методика ОТ-рвПЦР для оценки экспрессии генов «домашнего хозяйства» ACTB и SDHA в клетках восточноазиатской лесной мыши (A. peninsulae) и свиньи (S. scrofa). На следующем этапе исследования необходимо валидировать эти гены в качестве референтных для количественной оценки экспрессии генов млекопитающих-хозяев зоонозных инфекций в норме и при патологии.
Background. The molecular mechanisms behind the maintenance of zoonotic pathogens in nature can be better understood by examining the gene expression in host cells in response to the infection. Reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) is a powerful method to study gene expression, especially with the use of endogenous reference genes (RG) to normalize the data. Therefore, it is critical to develop the reliable qRT-PCR assay and validate that selected RGs are stably expressed in the studied organism or cell culture.The aim. In this work, we aimed to develop the real-time qRT-PCR method for detecting mRNA of two candidate RGs, succinate dehydrogenase subunit A (SDHA) and beta-actin (ACTB), in the cell lines of mammalian hosts of zoonotic infections.Materials and methods. The SPEV (porcine embryonic kidney cell line) and ApnK (Korean field mouse kidney cell line) cells were grown in 24-well culture plates. Total RNA/DNA was isolated from trypsin-detached cell monolayers. Genomic DNA in the samples was removed with RNase-free DNase I, and one-step RT-qPCR was performed using primers for SDHA and ACTB gene fragments and the corresponding TaqMan hydrolysis probes. The experiment was performed in 4 independent replicates.Results. In the Korean field mouse cells, the linearity, efficiency, repeatability, and reproducibility of the RT-qPCR for ACTB gene mRNA corresponded to the modern requirements. However, RT-qPCR for SDHA exhibited good linearity and efficiency of the reaction, but CV values for repeatability and reproducibility slightly exceeded the recommended standards. In porcine cells, both assays had acceptable parameters. Thus, to use the SDHA as RG for ApnK cells, a detailed study of the stability of its expression in this particular model is required.Conclusions. New qRT-PCR assay was developed to assess the expression of housekeeping genes ACTB and SDHA in the cells of the Korean field mouse and domestic pig. Further research is necessary to validate these genes as references for quantitative assessment of gene expression in the cells of mammalian hosts of zoonotic infections.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.