Быков Вячеслав Владимирович – техник лаборатории новых методов в биологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН – обособленное подразделение
142290, г. Пущино, просп. Науки, 3
Vyacheslav V. Bykov – Technician at the Laboratory of New Methods in biology
Nauki Ave. 3, Pushchino 142290
Вологжанникова Алиса Андреевна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории новых методов в биологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН – обособленное подразделение
142290, г. Пущино, просп. Науки, 3
Alisa A. Vologzhannikova – Cand. Sc. (Biol.), Senior Research Officer at the Laboratory of New Methods in biology
Nauki Ave. 3, Pushchino 142290
Трунилина Мария Викторовна – инженер-биотехнолог лаборатории новых методов в биологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН – обособленное подразделение
142290, г. Пущино, просп. Науки, 3
Maria V. Trunilina – Biotechnology Engineer at the Laboratory of New Methods in biology
Nauki Ave. 3, Pushchino 142290
Кудряшов Тимофей Андреевич – младший научный сотрудник лаборатории новых методов в биологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН – обособленное подразделение
142290, г. Пущино, просп. Науки, 3
Timofey A. Kudryashov – Junior Research Officer at the Laboratory of New Methods in biology
Nauki Ave. 3, Pushchino 142290
Соколов Андрей Сергеевич – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории новых методов в биологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН – обособленное подразделение
142290, г. Пущино, просп. Науки, 3
Andrey S. Sokolov – Cand. Sc. (Biol.), Senior Research Officer at the Laboratory of New Methods in biology
Nauki Ave. 3, Pushchino 142290
Лаптева Юлия Сергеевна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории новых методов в биологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН – обособленное подразделение
142290, г. Пущино, просп. Науки, 3
Yulia S. Lapteva – Cand. Sc. (Biol.), Senior Research Officer at the Laboratory of New Methods in biology
Nauki Ave. 3, Pushchino 142290
Обоснование. Метионин-аминопептидазы (МАП) – это класс ферментов, которые катализируют удаление N-концевого инициирующего метионина из полипептидной цепи. Бактериальные МАП рассматриваются в качестве мишеней для разработки антибактериальных препаратов широкого спектра действия, а применение МАП в биотехнологии обуславливает поиск новых МАП, исследование механизмов их функционирования и ингибирования.Цель исследования. Идентификация метионин-аминопептидазы в геноме Thermus thermophilus (Tt-МАП) и подтверждение её функциональной активности.Материалы и методы. Для идентификации Tt-МАП был проведён анализ генома Thermus thermophilus в базе данных GeneBank. Для клонирования в векторе pHUE предполагаемой открытой рамки считывания (ОРС), кодирующей Tt-МАП, были использованы современные методы генной инженерии (полимеразная цепная реакция, рестрикция, трансформация, гетерологичная экспрессия). Для получения очищенного препарата фермента были использованы различные методы хроматографии (аффинная, ионообменная и эксклюзионная). Для подтверждения специфической функциональной аминопептидазной активности фермента использовали флюорогенный субстрат L-метионин 7-амино-4-метилкумарин (Met-AMC).Результаты. В геноме бактерии Thermus thermophilus идентифицирована ОРС, кодирующая МАП. На основании нуклеотидной последовательности были составлены олигонуклеотидные праймеры. ОРС клонирована в векторе, и проведена наработка рекомбинантного фермента в клетках E. coli. С использованием ряда последовательных хроматографий разработана методика очистки фермента до гомогенного состояния, позволяющая получать до 30 мг с 1 л культуры. С использованием флюорогенного субстрата Met-AMC была показана специфическая функциональная активность фермента (фермент отщепляет метионин от субстрата).Заключение. Нами проведена идентификация МАП Thermus thermophilus и проверка её функциональной активности. Показано, что продукт ОРС TTHA1670 кодирует специфичную к метионину аминопептидазу, т. е. метионин-аминопептидазу. Фермент может быть использован в различных отраслях биотехнологии и научных исследованиях.
Background. Methionine aminopeptidases (MAPs) are a class of enzymes that catalyze the removal of the N-terminal initiator methionine from a polypeptide chain. Bacterial MAPs are considered as targets for the development of broad-spectrum antibacterial drugs, and using MAPs in biotechnology necessitates the search for new MAPs and the study of their functioning and inhibition mechanisms.The aim of the study. To identify methionine aminopeptidase in the Thermus thermophilus genome (Tt-MAP) and to confirm its functional activity.Materials and methods. To identify Tt-MAP, we analyzed the Thermus thermophilus genome in the GeneBank database. Modern genetic engineering techniques (polymerase chain reaction, restriction, transformation, heterologous expression) were used to clone the putative open reading frame (ORF) encoding Tt-MAP in the pHUE vector. Various chromatography techniques (affinity, ion exchange, and size-exclusion) were used to obtain a purified enzyme preparation. The fluorogenic substrate L-methionine 7-amino-4-methylcoumarin (Met-AMC) was used to confirm the specific functional aminopeptidase activity of the enzyme.Results. An ORF encoding MAP was identified in the Thermus thermophilus bacterium genome. Oligonucleotide primers were designed based on the nucleotide sequence. The ORF was cloned in the vector, and the recombinant enzyme was produced in E. coli cells. A method for purifying the enzyme to a homogeneous state was developed using a series of sequential chromatographies, allowing up to 30 mg to be obtained from 1 liter of culture. Using the fluorogenic substrate Met-AMC, the specific functional activity of the enzyme was demonstrated (the enzyme cleaves methionine from the substrate).Conclusion. We have identified the Thermus thermophilus MAP and tested its functional activity. It has been shown that the ORF product TTHA1670 encodes a methionine-specific aminopeptidase, i. e. methionine aminopeptidase. The enzyme can be used in various fields of biotechnology and scientific research.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.