actabiomedicaActa Biomedica ScientificaActa Biomedica Scientifica2541-94202587-9596Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems10.29413/ABS.2023-8.4.2actabiomedica-4325Research ArticleДИСКУССИОННЫЕ СТАТЬИ, ЛЕКЦИИ, НОВЫЕ ТРЕНДЫ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИDISCUSSION PAPERS, LECTURES, NEW TRENDS IN MEDICAL SCIENCEВыделение и полногеномное секвенирование липофильной анаэробной бактерии, представителя видового комплекса Corynebacterium tuberculostearicum, из туберкулёзного очагаIsolation and whole genome sequencing of a lipophilic anaerobic bacterium, a representative of the species complex Corynebacterium tuberculostearicum, from a tuberculosis focushttps://orcid.org/0000-0002-3168-1983ОгарковО. Б.OgarkovO. B.

Огарков Олег Борисович – доктор медицинских наук, заведующий отделом эпидемиологии и микробиологии 

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

Oleg B. Ogarkov – Dr. Sc. (Med.), Head of the Department of Epidemiology and Microbiology 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003

obogarkov@mail.ruСуздальницкийА. Е.SuzdalnitskyA. E.

Суздальницкий Алексей Евгеньевич – торакальный хирург, заведующий хирургическим отделением; ассистент кафедры фтизиопульмонологии 

664039, г. Иркутск, ул. Терешковой, 39;664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1

Alexey E. Suzdalnitsky – Thoracic Surgeon, Head of the Surgical Department; Teaching Assistant at the Department of Phthisiopulmonology 

Tereshkovoy str. 59, Irkutsk 664039; Krasnogo Vosstaniya str. 1, Irkutsk 664003

irksae@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2631-4724КондратовИ. Г.KondratovI. G.

Кондратов Илья Геннадьевич – кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела эпидемиологии и микробиологии 

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

Ilya G. Kondratov – Research Officer at the Department of Epidemiology and Microbiology 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003

kondratovig@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4534-3846БукинЮ. С.BukinYu. S.

Букин Юрий Сергеевич – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник 

664033, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3

Yurij S. Bukin – Senior Research Officer 

Ulan-Batorskaya str. 3, Irkutsk 664033

bukinyura@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2169-0242ОрловаЕ. А.OrlovaE. A.

Орлова Елизавета Андреевна – младший научный сотрудник лаборатории эпидемиологически и социально-значимых инфекций, аспирант 

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

Elizaveta A. Orlova – Junior Research Officer at the Laboratory of Epidemically and Socially Significant Infections, Postgraduate 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003

elizaveta.a.orlova@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-3396-9590СиньковВ. В.SinkovV. V.

Синьков Вячеслав Владимирович – кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории эпидемиологически и социально-значимых инфекций 

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

Viacheslav V. Sinkov – Cand. Sc. (Med.), Senior Research Officer at the Laboratory of Epidemically and Socially Significant Infections 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003

vsinkov@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-7160-9700ЖдановаС. Н.ZhdanovaS. N.

Жданова Светлана Николаевна – доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории эпидемиологически и социально-значимых инфекций 

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

Svetlana N. Zhdanova – Dr. Sc. (Med.), Leading Research Officer at the Laboratory of Epidemically and Socially Significant Infections 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003

svetnii@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9720-068XБельковаН. Л.BelkovaN. L.

Белькова Наталья Леонидовна – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующая лабораторией микробиома и микроэкологии 

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

Natalia L. Belkova – Cand. Sc. (Biol.), Leader Research Officer at the Laboratory of Microbiome and Microecology 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003

nlbelkova@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0117-2563РычковаЛ. В.RychkovaL. V.

Рычкова Любовь Владимировна – доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, директор 

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

Lyubov V. Rychkova – Dr. Sc. (Med.), Corresponding Member of the RAS, Director 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003

iphr@sbamsr.irk.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3354-2992КолесниковаЛ. И.KolesnikovaL. I.

Колесникова Любовь Ильинична – доктор медицинских наук, академик РАН, научный руководитель 

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16

Lyubov I. Kolesnikova – Dr. Sc. (Med.), Academician of the RAS, Scientific Advisor 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003

iphr@sbamsr.irk.ruФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction ProblemsОГБУЗ «Иркутская областная клиническая туберкулёзная больница»; ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава РоссииIrkutsk Regional Clinical Tuberculosis Hospital; Irkutsk State Medical UniversityФГБУН Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наукLimnological Institute of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences202327092023841219Copyright © Огарков О.Б., Суздальницкий А.Е., Кондратов И.Г., Букин Ю.С., Орлова Е.А., Синьков В.В., Жданова С.Н., Белькова Н.Л., Рычкова Л.В., Колесникова Л.И., 20232023Огарков О.Б., Суздальницкий А.Е., Кондратов И.Г., Букин Ю.С., Орлова Е.А., Синьков В.В., Жданова С.Н., Белькова Н.Л., Рычкова Л.В., Колесникова Л.И.Ogarkov O.B., Suzdalnitsky A.E., Kondratov I.G., Bukin Y.S., Orlova E.A., Sinkov V.V., Zhdanova S.N., Belkova N.L., Rychkova L.V., Kolesnikova L.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.actabiomedica.ru/jour/article/view/4325Обоснование

Обоснование. Исследование микробиома нижних дыхательных путей активно развивается последние несколько лет за счёт применения методов полногеномного секвенирования (WGS, whole genome sequencing). Благодаря этому стало понятно, что природа микробиоты лёгких сильно отличается от других микробных сообществ, населяющих тело человека. Одним из важных направлений исследования патологических биоценозов в лёгких является изучение роли сателлитной микробиоты туберкулёзного очага.

Цель работы

Цель работы. Выделение и характеристика толерантных к кислороду анаэробов из некротического содержимого туберкулом.

Материалы и методы

Материалы и методы. Биопсийный материал от 5 больных туберкулёзом лёгких был получен в процессе плановой операции по иссечению туберкулом. Из одного образца при анаэробном культивировании была выделена чистая культура. Липазную активность штамма определяли посевом на сердечномозговой агар (HIMEDIA, Индия) с добавлением 0,1 % Tween-80 и 10 мМ CaCl2. Чувствительность к антибиотикам определялась в RAPMYCO и SLOWMYCO TREK Diagnostic Systems (Thermo Fisher Scientific, США). ДНК из осадка бульонной культуры выделяли CTAB-хлороформным методом. Полногеномное секвенирование осуществлено на NGS-секвенаторе DNBSeq-G400 компанией «Геномед» (Россия).

Результаты

Результаты. По результатам WGS и по данным филогенетического анализа штамм был идентифицирован как Corynebacterium kefirresidentii. Штамм характеризовался высокой липазной активностью и устойчивостью только к изониазиду, этионамиду и триметоприму/сульфаметоксазолу.

Заключение

Заключение. Выделение из туберкулёзного очага липофильного анаэробного представителя видового комплекса Corynebacterium tuberculostearicum свидетельствует о возможной роли нетуберкулёзной микробиоты в  процессах разжижения казеозного некроза. Нами выдвигается гипотеза о том, что внутри туберкулёзного очага в некоторых случаях создаются благоприятные условия для развития вторичной анаэробной липофильной микробиоты.

Background

Background. The study of the lower respiratory tract microbiome has been actively developed inrecent years with the help of whole genome sequencing (WGS) methods. Due to this, it became clear that the nature of the lungs microbiota is very different from other microbial communities inhabiting the human body. One of the important directions in the study of pathological lungs biocenosis is the study of the role of the satellite microbiota of the tuberculosis focus.

The aim of the work

The aim of the work. To isolate and characterize oxygen-tolerant anaerobes from the necrotic contents of tuberculomas.

Materials and methods

Materials and methods. Biopsy material from 5 patients with pulmonary tuberculosis was obtained during a planned surgical treatment of tuberculoma. A pure culture was isolated from one sample during anaerobic cultivation. Lipase activity of strain was determined by plating on brain heart infusion agar (HIMEDIA, India) supplemented with 0.1 % Tween-80 and 10 mM of CaCl2. Antibiotic susceptibility was determined by RAPMYCO and SLOWMYCO of TREK Diagnostic Systems (Thermo Fisher Scientific, USA). DNA from the sediment of the broth culture was isolated by the CTAB chloroform method. Whole genome sequencing was performed on a DNBSeq-G400 NGS sequencer by Genomed (Russia).

Results

Results. Based on WGS results and phylogenetic analysis, the strain was identified as Corynebacterium kefirresidentii. The strain was characterized by high lipase activity and resistance only to Isoniazid, Ethionamide and Trimethoprim/Sulfamethoxazolin.

Conclusion

Conclusion. The isolation of a lipophilic anaerobic representative of the Corynebacterium tuberculostearicum species complex from a tuberculous focus indicates a  possible role of the non-tuberculous microbiota in the liquefaction of caseous necrosis. We assumed that in some cases, favorable conditions are created inside the tuberculous focus for the development of satellite anaerobic lipophilic microbiota.

микробиом туберкулёзного очагатуберкуломаWGSCorynebacterium kefirresidentiimicrobiome of tuberculosis focustuberculomaWGSCorynebacterium kefirresidentiiИсследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда (проект № 23-15-00280).ReferencesNatalini JG, Singh S, Segal LN. The dynamic lung microbiome in health and disease. Nat Rev Microbiol. 2023; 21: 222-235. doi: 10.1038/s41579-022-00821-xNatalini JG, Singh S, Segal LN. The dynamic lung microbiome in health and disease. Nat Rev Microbiol. 2023; 21: 222-235. doi: 10.1038/s41579-022-00821-xMan W, de Steenhuijsen Piters W, Bogaert D. The microbiota of the respiratory tract: Gatekeeper to respiratory health. Nat Rev Microbiol. 2017; 15: 259-270. doi: 10.1038/nrmicro.2017.14Man W, de Steenhuijsen Piters W, Bogaert D. The microbiota of the respiratory tract: Gatekeeper to respiratory health. Nat Rev Microbiol. 2017; 15: 259-270. doi: 10.1038/nrmicro.2017.14Remot A, Descamps D, Noordine ML, Boukadiri A, Mathieu E, Robert V, et al. Bacteria isolated from lung modulate asthma susceptibility in mice. ISME J. 2017; 11(5): 1061-1074. doi: 10.1038/ismej.2016.181Remot A, Descamps D, Noordine ML, Boukadiri A, Mathieu E, Robert V, et al. Bacteria isolated from lung modulate asthma susceptibility in mice. ISME J. 2017; 11(5): 1061-1074. doi: 10.1038/ismej.2016.181Hilty M, Burke C, Pedro H, Cardenas P, Bush A, Bossley C, et al. Disordered microbial communities in asthmatic airways. PLoS One. 2010; 5(1): e8578. doi: 10.1371/journal.pone.0008578Hilty M, Burke C, Pedro H, Cardenas P, Bush A, Bossley C, et al. Disordered microbial communities in asthmatic airways. PLoS One. 2010; 5(1): e8578. doi: 10.1371/journal.pone.0008578Guarner F, Malagelada JR. Gut flora in health and disease. Lancet. 2003; 361(9356): 512-519. doi: 10.1016/S0140-6736(03)12489-0Guarner F, Malagelada JR. Gut flora in health and disease. Lancet. 2003; 361(9356): 512-519. doi: 10.1016/S0140-6736(03)12489-0de Steenhuijsen Piters WAA, Binkowska J, Bogaert D. Early life microbiota and respiratory tract infections. Cell Host Microbe. 2020; 12; 28(2): 223-232. doi: 10.1016/j.chom.2020.07.004de Steenhuijsen Piters WAA, Binkowska J, Bogaert D. Early life microbiota and respiratory tract infections. Cell Host Microbe. 2020; 12; 28(2): 223-232. doi: 10.1016/j.chom.2020.07.004Orlova EA, Ogarkov OB, Suzdalnitskiy AE, Khromova PA, Sinkov VV, Plotnikov AO, et al. Analysis of microbial diversity in caseous necrosis of tuberculosis foci. Mol Genet Microbiol Virol. 2021; (36): 132-138. doi: 10.3103/S0891416821030058Orlova EA, Ogarkov OB, Suzdalnitskiy AE, Khromova PA, Sinkov VV, Plotnikov AO, et al. Analysis of microbial diversity in caseous necrosis of tuberculosis foci. Mol Genet Microbiol Virol. 2021; (36): 132-138. doi: 10.3103/S0891416821030058Огарков О.Б., Суздальницкий А.Е., Хромова П.А., Цыренова Т.А., Сокольникова Н.А., Жданова С.Н., и др. Продукция биофильмов клиническими штаммами возбудителя туберкулеза. Инфекция и иммунитет. 2018; 8(4): 435-440. doi: 10.15789/2220-7619-2018-4-435-440Ogarkov OB, Suzdalnitsky AE, Khromova PA, Tsyrenova TA, Sokolnikova NA, Zhdanova SN, et al. Biofilm formation induced by clinical isolates of mycobacterium tuberculosis. Russian Journal of Infection and Immunity. 2018; 8(4): 435-440. (In Russ.). doi: 10.15789/2220-7619-2018-4-435-440Ogarkov OB, Badleeva V, Belkova NL, Adelshin RV, Tsyrenova TA, Khromova PA, et al. The phenomenon of the formation of biofilms by Brevibacillus spp. and Bacillus spp. in the presence of clinical strains of Mycobacterium tuberculosis. Mol Genet Microbiol Virol. 2017; (32): 148-154. doi: 10.3103/S0891416817030065Ogarkov OB, Badleeva V, Belkova NL, Adelshin RV, Tsyrenova TA, Khromova PA, et al. The phenomenon of the formation of biofilms by Brevibacillus spp. and Bacillus spp. in the presence of clinical strains of Mycobacterium tuberculosis. Mol Genet Microbiol Virol. 2017; (32): 148-154. doi: 10.3103/S0891416817030065Cronan MR. In the thick of it: Formation of the tuberculous granuloma and its effects on host and therapeutic responses. Front Immunol. 2022; 7(13): 820134. doi: 10.3389/fimmu.2022.820134Cronan MR. In the thick of it: Formation of the tuberculous granuloma and its effects on host and therapeutic responses. Front Immunol. 2022; 7(13): 820134. doi: 10.3389/fimmu.2022.820134Холодок О.А., Григоренко А.А., Черемкин М.И. Туберкулема легкого как форма туберкулезного процесса. Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2014; (53): 126-131.Kholodok OA, Grigorenko AA, Cheryemkin MI. Pulmonary tuberculoma as a form of tuberculous process. Bulletin Physiology and Pathology of Respiration. 2014; (53): 126-131. (In Russ.).Russell DG, Cardona PJ, Kim MJ, Allain S, Altare F. Foamy macrophages and the progression of the human tuberculosis granuloma. Nat Immunol. 2009; 10(9): 943-948. doi: 10.1038/ni.1781Russell DG, Cardona PJ, Kim MJ, Allain S, Altare F. Foamy macrophages and the progression of the human tuberculosis granuloma. Nat Immunol. 2009; 10(9): 943-948. doi: 10.1038/ni.1781Brown-Elliott BA, Woods GL. Antimycobacterial susceptibility testing of nontuberculous mycobacteria. J Clin Microbiol. 2019; 57(10): e00834-19. doi: 10.1128/JCM.00834-19Brown-Elliott BA, Woods GL. Antimycobacterial susceptibility testing of nontuberculous mycobacteria. J Clin Microbiol. 2019; 57(10): e00834-19. doi: 10.1128/JCM.00834-19Медведева Т.В., Огарков О.Б., Некипелов О.М., Ушаков И.В., Козьякова Е.С., Скворцова Р.Г. MIRU-VNTRгенотипирование штаммов Mycobacterium tuberculosis в Восточной Сибири: семейство Beijing против Kilimanjaro. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2004; (4): 33-38.Medvedeva TV, Ogarkov OB, Nekipelova OM, Ushakov IV, Kozyakova ES, Skvortsova RG. MIRU-VNTR genotyping of Mycobacterium tuberculosis strains from East Siberia: Beijing family versus Kilimanjaro family. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2004; (4): 33-38. (In Russ.).Prjibelski A, Antipov D, Meleshko D, Lapidus A, Korobeynikov A. Using SPAdes de novo assembler. Curr Prot Bioinform. 2020; 70(1): e102. doi: 10.1002/cpbi.102Prjibelski A, Antipov D, Meleshko D, Lapidus A, Korobeynikov A. Using SPAdes de novo assembler. Curr Prot Bioinform. 2020; 70(1): e102. doi: 10.1002/cpbi.102Tamames J, Puente-Sánchez F. SqueezeMeta, a highly portable, fully automatic metagenomic analysis pipeline. Front Microbiol. 2019; 9: 3349. doi: 10.3389/fmicb.2018.03349Tamames J, Puente-Sánchez F. SqueezeMeta, a highly portable, fully automatic metagenomic analysis pipeline. Front Microbiol. 2019; 9: 3349. doi: 10.3389/fmicb.2018.03349Meier-Kolthoff JP, Auch AF, Klenk HP, Göker M. Genome sequence-based species delimitation with confidence intervals and improved distance functions. BMC Bioinformatics. 2013; 14: 1-14. doi: 10.1186/1471-2105-14-60Meier-Kolthoff JP, Auch AF, Klenk HP, Göker M. Genome sequence-based species delimitation with confidence intervals and improved distance functions. BMC Bioinformatics. 2013; 14: 1-14. doi: 10.1186/1471-2105-14-60Katoh K, Standley DM. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: Improvements in performance and usability. Mol Biol Evol. 2013; 30(4): 772-780. doi: 10.1093/molbev/mst010Katoh K, Standley DM. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: Improvements in performance and usability. Mol Biol Evol. 2013; 30(4): 772-780. doi: 10.1093/molbev/mst010Minh BQ, Schmidt HA, Chernomor O, Schrempf D, Woodhams MD, von Haeseler A, et al. IQ-TREE 2: New models and efficient methods for phylogenetic inference in the genomic era. Mol Biol Evol. 2020; 37(5): 1530-1534. doi: 10.1093/molbev/msaa015Minh BQ, Schmidt HA, Chernomor O, Schrempf D, Woodhams MD, von Haeseler A, et al. IQ-TREE 2: New models and efficient methods for phylogenetic inference in the genomic era. Mol Biol Evol. 2020; 37(5): 1530-1534. doi: 10.1093/molbev/msaa015Edgar RC. Updating the 97 % identity threshold for 16S ribosomal RNA OTUs. Bioinformatics. 2018; 34(14): 2371-2375. doi: 10.1093/bioinformatics/bty113Edgar RC. Updating the 97 % identity threshold for 16S ribosomal RNA OTUs. Bioinformatics. 2018; 34(14): 2371-2375. doi: 10.1093/bioinformatics/bty113Boxberger M, Antezack A, Magnien S, Cassir N, La Scola B. Complete genome and description of Corynebacterium incognita sp. nov.: A new bacterium within the Corynebacterium genus. New Microbes New Infect. 2021; 42: 100893. doi: 10.1016/j.nmni.2021.100893Boxberger M, Antezack A, Magnien S, Cassir N, La Scola B. Complete genome and description of Corynebacterium incognita sp. nov.: A new bacterium within the Corynebacterium genus. New Microbes New Infect. 2021; 42: 100893. doi: 10.1016/j.nmni.2021.100893Council SE, Savage AM, Urban JM, Ehlers ME, Skene JH, Platt ML, et al. Diversity and evolution of the primate skin microbiome. Proc Biol Sci. 2016; 283(1822): 20152586. doi: 10.1098/rspb.2015.2586Council SE, Savage AM, Urban JM, Ehlers ME, Skene JH, Platt ML, et al. Diversity and evolution of the primate skin microbiome. Proc Biol Sci. 2016; 283(1822): 20152586. doi: 10.1098/rspb.2015.2586Salamzade R, Swaney MH, Kalan LR. Comparative genomic and metagenomic investigations of the Corynebacterium tuberculostearicum species complex reveals potential mechanisms underlying associations to skin health and disease. Microbiol Spectr. 2023; 11(1): e0357822. doi: 10.1128/spectrum.03578-22Salamzade R, Swaney MH, Kalan LR. Comparative genomic and metagenomic investigations of the Corynebacterium tuberculostearicum species complex reveals potential mechanisms underlying associations to skin health and disease. Microbiol Spectr. 2023; 11(1): e0357822. doi: 10.1128/spectrum.03578-22Dover LG, Thompson AR, Sutcliffe IC, Sangal V. Phylogenomic reappraisal of fatty acid biosynthesis, mycolic acid biosynthesis and clinical relevance among members of the genus Corynebacterium. Front Microbiol. 2021; 12: 802532. doi: 10.3389/fmicb.2021.802532Dover LG, Thompson AR, Sutcliffe IC, Sangal V. Phylogenomic reappraisal of fatty acid biosynthesis, mycolic acid biosynthesis and clinical relevance among members of the genus Corynebacterium. Front Microbiol. 2021; 12: 802532. doi: 10.3389/fmicb.2021.802532Morlock GP, Metchock B, Sikes D, Crawford JT, Cooksey RC. ethA, inhA, and katG loci of ethionamide-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2003; 47(12): 3799-3805. doi: 10.1128/AAC.47.12.3799-3805.2003Morlock GP, Metchock B, Sikes D, Crawford JT, Cooksey RC. ethA, inhA, and katG loci of ethionamide-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2003; 47(12): 3799-3805. doi: 10.1128/AAC.47.12.3799-3805.2003

The authors declare that there are no conflicts of interest present.