actabiomedicaActa Biomedica ScientificaActa Biomedica Scientifica2541-94202587-9596Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems10.29413/ABS.2022-7.6.9actabiomedica-3885Research ArticleКЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАCLINICAL LABORATORY DIAGNOSISОпыт разработки и валидации метода определения тестостерона в сыворотке крови женщин репродуктивного возраста с использованием высокоэффективной жидкостной обращённо-фазовой хроматографии с тандемной масс-селективной детекцией аналитаThe experience in the development and validation of method for testosterone measurement in blood serum of premenopausal women using HPLC-MS/MShttps://orcid.org/0000-0002-6271-7803СутуринаЛ. В.SuturinaL. V.

Сутурина Лариса Викторовна – доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории гинекологической эндокринологии 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Larisa V. Suturina – Dr. Sc. (Med.), Chief Research Officer at the Laboratory of Gynecological Endocrinology

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

Lsuturina@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3678-7274БельскихА. В.BelskikhA. V.

Бельских Алексей Владимирович – кандидат химических наук, инженер лаборатории персонализированной медицины 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Aleksey V. Belskikh – Cand. Sc. (Chem.), Engineer at the Laboratory of Personalized Medicine 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

alex590750@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3588-6545ШолоховЛ. Ф.SholokhovL. F.

Шолохов Леонид Федорович – доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии и патологии эндокринной системы 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Leonid F. Sholokhov – Dr. Sc. (Med.), Professor, Leading Research Officer at the Laboratory of Physiology and Pathology of the Endocrine System 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

lfshol@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4730-5154РашидоваМ. А.RashidovaM. A.

Рашидова Мария Александровна – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории физиологии и патологии эндокринной системы 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Maria A. Rashidova – Cand. Sc. (Biol.), Research Officer at the Laboratory of Physiology and Pathology of the Endocrine System 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

rashidovama@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8862-5771ДанусевичИ. Н.DanusevichI. N.

Данусевич Ирина Николаевна – доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории гинекологической эндокринологии 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Irina N. Danusevich – Dr. Sc. (Med.), Leading Research Officer at the Laboratory of Gynecological Endocrinology 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

irinaemails@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-7662-8529ЛазареваЛ. М.LazarevaL. M.

Лазарева Людмила Михайловна – кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории гинекологической эндокринологии 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Lyudmila M. Lazareva – Cand. Sc. (Med.), Research Officer at the Laboratory of Gynecological Endocrinology 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

lirken_@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5747-7315НаделяеваЯ. Г.NadeliaevaI. G.

Наделяева Яна Геннадьевна – кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории гинекологической эндокринологии 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Iana G. Nadeliaeva – Cand. Sc. (Med.), Research Officer at the Laboratory of Gynecological Endocrinology 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

ianadoc@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4904-3709БеленькаяЛ. В.BelenkaiaL. V.

Беленькая Лилия Васильевна – кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии и патологии эндокринной системы 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Liliia V. Belenkaia – Cand. Sc. (Med.), Research Officer at the Laboratory of Physiology and Pathology of the Endocrine System 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

drblv@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3407-9365АталянА. В.AtalyanA. V.

Аталян Алина Валерьевна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории социально значимых проблем репродуктологии,  

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Alina V. Atalyan – Cand. Sc. (Biol.), Senior Research Officer at the Laboratory of Socially Significant Infections in Reproductive Medicine 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

alinaa@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7604-6246ВильсонН. И.VilsonN. I.

Вильсон Наталия Игоревна – младший научный сотрудник лаборатории физиологии и патологии эндокринной системы 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Natalia I. Vilson – Junior Research Officer at the Laboratory of Physiology and Pathology of the Endocrine System 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

miracle_909@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1078-3657ИгумновИ. А.IgumnovI. A.

Игумнов Илья Андреевич – младший научный сотрудник лаборатории гинекологической эндокринологии 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Ilia A. Igumnov – Junior Research Officer at the Laboratory of Gynecological Endocrinology 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

iigumnov7@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0177-234XИевлеваК. Д.IevlevaK. D.

Иевлева Ксения Дмитриевна – кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник лаборатории гинекологической эндокринологии 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Kseniia D. Ievleva – Cand. Sc. (Med.), Junior Research Officer at the Laboratory of Gynecological Endocrinology 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

asiy91@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6847-9810ЕгороваИ. Ю.EgorovaI. Yu.

Егорова Ирина Юрьевна – младший научный сотрудник лаборатории гинекологической эндокринологии 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Irina Yu. Egorova – Junior Research Officer at the Laboratory of Gynecological Endocrinology 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

egorovairina1994@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-3704-830XБаироваТ. А.BairovaT. A.

Баирова Татьяна Ананьевна – доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории персонализированной медицины 

 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия 

Tatyana A. Bairova – Dr. Sc. (Med.), Leading Research Officer at the Laboratory of Personalized Medicine 

Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation 

tbairova38@mail.ruФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems2022291220227692101Copyright © Сутурина Л.В., Бельских А.В., Шолохов Л.Ф., Рашидова М.А., Данусевич И.Н., Лазарева Л.М., Наделяева Я.Г., Беленькая Л.В., Аталян А.В., Вильсон Н.И., Игумнов И.А., Иевлева К.Д., Егорова И.Ю., Баирова Т.А., 20222022Сутурина Л.В., Бельских А.В., Шолохов Л.Ф., Рашидова М.А., Данусевич И.Н., Лазарева Л.М., Наделяева Я.Г., Беленькая Л.В., Аталян А.В., Вильсон Н.И., Игумнов И.А., Иевлева К.Д., Егорова И.Ю., Баирова Т.А.Suturina L.V., Belskikh A.V., Sholokhov L.F., Rashidova M.A., Danusevich I.N., Lazareva L.M., Nadeliaeva I.G., Belenkaia L.V., Atalyan A.V., Vilson N.I., Igumnov I.A., Ievleva K.D., Egorova I.Y., Bairova T.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.actabiomedica.ru/jour/article/view/3885

Обоснование. Исследование тестостерона является основным методом выявления гиперандрогенизма, одного из важных критериев диагностики синдрома поликистозных яичников (СПКЯ). Жидкостная тандемная массспектрометрия (ЖХ-МС/МС) рассматривается в настоящее время как наиболее предпочтительный метод определения тестостерона у женщин, а его валидация является необходимым этапом для обеспечения воспроизводимых результатов исследования андрогенов в клинической практике и при проведении популяционных исследований распространённости СПКЯ.Цель работы. Разработать и валидировать метод определения общего тестостерона в сыворотке крови с использованием высокоэффективной ЖХ-МС/МС для диагностики гиперандрогенемии при проведении эпидемиологического исследования распространённости синдрома поликистозных яичников и его фенотипов в Восточной Сибири (ESPEP STUDY).Материалы и методы. Определение тестостерона в сыворотке крови проводилось с применением трёхквадрупольного тандемного массспектрометра LCMS-8060 (Shimadzu, Япония). Метод разработан с применением самостоятельно приготовленных образцов очищенной сыворотки крови человека, свободной от тестостерона, с известным содержанием исследуемого аналита. При апробации методики использованы образцы сыворотки крови женщин репродуктивного возраста.Результаты. В ходе разработки метода оптимальные хроматографические условия получили при использовании колонки Kromasil 100-2.5-C18 (2,1 мм × 100 мм; AkzoNobel, Нидерланды), при изократическом режиме элюирования с применением подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила и 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты. Общая скорость потока составила 0,35 мл/мин. Нижний предел количественного определения составил 5 нг/дл со средней точностью 100,2 %. При апробации метода в тестовой популяционной выборке из 1138 женщин репродуктивного возраста (средний возраст – 34,3 ± 6,3 года) медиана концентрации тестостерона составила 26,9 нг/дл.Заключение. Предложенный метод определения тестостерона в сыворотке крови обладает приемлемой точностью, линейностью и воспроизводимостью, характеризуется простой и быстрой пробоподготовкой и может использоваться при проведении популяционных эпидемиологических исследований распространённости СПКЯ и его фенотипов и в клинической практике.

Testosterone assessment is essential for detecting biochemical hyperandrogenism, one of the important diagnostic criteria of polycystic ovary syndrome (PCOS) both in clinical practice and in epidemiological studies. Currently, tandem liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) is the most preferred technique to measure testosterone level in women. Its validation is important to reproducibility of androgen tests results for clinical practice and for epidemiological studies of the prevalence PCOS.The aim of the study. To develop and validate a method for determining total testosterone in blood serum using highly efficient LC-MS/MS to assess androgenemia in the epidemiological study of the prevalence of PCOS and its phenotypes in Eastern Siberia (ESPEP STUDY).Materials and methods. We determined a total testosterone level in serum blood using triple quadrupole mass spectrometer LCMS-8060 (Shimadzu, Japan). The protocol of technique was developed using self-prepared purified human testosteronefree serum with a known concentration of analyzed compound. We used the serum samples of women of reproductive age to test the developed method.Results. Optimum chromatographic conditions were obtained with a Kromasil 100-2.5-C18 column (2.1 mm × 100 mm; AkzoNobel, Netherlands), and an isocratic elution mode using a mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1 % aqueous solution of formic acid. The total flow rate was 0.35 ml/min. The lower limit of quantification was 5 ng/dl with an average accuracy of 100.2 %. During the approbation of the method in a test population sample of 1138 premenopausal women (mean age – 34.3 ± 6.3 years), the median testosterone concentration was 26.9 ng/dl.Conclusion. It was found that the proposed method for determining testosterone in blood serum has acceptable linearity and reproducibility and meets the requirements for bioanalytical methods under the regulatory documentation. This method can be used for clinical practice and epidemiological study of the prevalence of PCOS.

тестостеронвалидацияВЭЖХ-МС/МСгиперандрогенизмСПКЯtestosteronevalidationHPLC-MS/MShyperandrogenismPCOSАвторы выражают признательность Cristina Wang (Clinical and Translational Science Institute, LA Biomedical Research Institute, Division of Endocrinology, Department of Medicine, Harbor-Univ of Calif-LA Medical Center, Torrance, CA, USA) за консультативную помощь и предоставленную возможность стажировки, а также Frank Stanczyk (Department of Obstetrics and Gynecology, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA.) за консультативную помощь при разработке и проведении валидации метода.ReferencesLizneva D, Suturina L, Walker W, Brakta S, Gavrilova-Jordan L, Azziz R. Criteria, prevalence, and phenotypes of polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2016; 106(1): 6-15. doi: 10.1016/j.fertnstert.2016.05.003Lizneva D, Suturina L, Walker W, Brakta S, Gavrilova-Jordan L, Azziz R. Criteria, prevalence, and phenotypes of polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2016; 106(1): 6-15. doi: 10.1016/j.fertnstert.2016.05.003Teede HJ, Misso ML, Costello MF, Dokras A, Laven J, Moran L, et al. Recommendations from the international evidence-based guideline for the assessment and management of polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2018; 110(3): 364-379. doi: 10.1016/j.fertnstert.2018.05.004Teede HJ, Misso ML, Costello MF, Dokras A, Laven J, Moran L, et al. Recommendations from the international evidence-based guideline for the assessment and management of polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2018; 110(3): 364-379. doi: 10.1016/j.fertnstert.2018.05.004Fauser BC, Tarlatzis BC, Rebar RW, Legro RS, Balen AH, Lobo R, et al. Consensus on women’s health aspects of polycystic ovary syndrome (PCOS): The Amsterdam ESHRE/ASRM-Sponsored 3rd PCOS Consensus Workshop Group. Fertil Steril. 2012; 97(1): 28-38.e25. doi: 10.1016/j.fertnstert.2011.09.024Fauser BC, Tarlatzis BC, Rebar RW, Legro RS, Balen AH, Lobo R, et al. Consensus on women’s health aspects of polycystic ovary syndrome (PCOS): The Amsterdam ESHRE/ASRM-Sponsored 3rd PCOS Consensus Workshop Group. Fertil Steril. 2012; 97(1): 28-38.e25. doi: 10.1016/j.fertnstert.2011.09.024Lizneva D, Gavrilova-Jordan L, Walker W, Azziz R. Androgen excess: Investigations and management. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2016; 37: 98-118. doi: 10.1016/j.bpobgyn.2016.05.003Lizneva D, Gavrilova-Jordan L, Walker W, Azziz R. Androgen excess: Investigations and management. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2016; 37: 98-118. doi: 10.1016/j.bpobgyn.2016.05.003Bozdag G, Mumusoglu S, Zengin D, Karabulut E, Yildiz BO. The prevalence and phenotypic features of polycystic ovary syndrome: A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 2016; 31(12): 2841-2855. doi: 10.1093/humrep/dew218Bozdag G, Mumusoglu S, Zengin D, Karabulut E, Yildiz BO. The prevalence and phenotypic features of polycystic ovary syndrome: A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 2016; 31(12): 2841-2855. doi: 10.1093/humrep/dew218Boyle JA, Cunningham J, O’Dea K, Dunbar T, Norman RJ. Prevalence of polycystic ovary syndrome in a sample of Indigenous women in Darwin, Australia. Med J Aust. 2012; 196(1): 62-66. doi: 10.5694/mja11.10553Boyle JA, Cunningham J, O’Dea K, Dunbar T, Norman RJ. Prevalence of polycystic ovary syndrome in a sample of Indigenous women in Darwin, Australia. Med J Aust. 2012; 196(1): 62-66. doi: 10.5694/mja11.10553Azziz R, Kintziger K, Li R, Laven J, Morin-Papunen L, Merkin SS, et al. Recommendations for epidemiologic and phenotypic research in polycystic ovary syndrome: An androgen excess and PCOS society resource. Hum Reprod. 2019; 34(11): 2254-2265. doi: 10.1093/humrep/dez185Azziz R, Kintziger K, Li R, Laven J, Morin-Papunen L, Merkin SS, et al. Recommendations for epidemiologic and phenotypic research in polycystic ovary syndrome: An androgen excess and PCOS society resource. Hum Reprod. 2019; 34(11): 2254-2265. doi: 10.1093/humrep/dez185Chen Y, Yazdanpanah M, Hoffman BR, Diamandis EP, Wong PY. Rapid determination of serum testosterone by liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry and a split sample comparison with three automated immunoassays. Clin Biochem. 2009; 42(6): 484-490. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2008.11.009Chen Y, Yazdanpanah M, Hoffman BR, Diamandis EP, Wong PY. Rapid determination of serum testosterone by liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry and a split sample comparison with three automated immunoassays. Clin Biochem. 2009; 42(6): 484-490. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2008.11.009Rosner W, Auchus RJ, Azziz R, Sluss PM, Raff H. Position statement: Utility, limitations, and pitfalls in measuring testosterone: An Endocrine Society position statement. J Clin Endocrinol Metab. 2007; 92(2): 405-413. doi: 10.1210/jc.2006-1864Rosner W, Auchus RJ, Azziz R, Sluss PM, Raff H. Position statement: Utility, limitations, and pitfalls in measuring testosterone: An Endocrine Society position statement. J Clin Endocrinol Metab. 2007; 92(2): 405-413. doi: 10.1210/jc.2006-1864Salameh WA, Redor-Goldman MM, Clarke NJ, Mathur R, Azziz R, Reitz RE. Specificity and predictive value of circulating testosterone assessed by tandem mass spectrometry for the diagnosis of polycystic ovary syndrome by the National Institutes of Health 1990 criteria. Fertil Steril. 2014; 101(4): 1135-1141.e2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.12.056Salameh WA, Redor-Goldman MM, Clarke NJ, Mathur R, Azziz R, Reitz RE. Specificity and predictive value of circulating testosterone assessed by tandem mass spectrometry for the diagnosis of polycystic ovary syndrome by the National Institutes of Health 1990 criteria. Fertil Steril. 2014; 101(4): 1135-1141.e2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.12.056Stanczyk FZ, Clarke NJ. Advantages and challenges of mass spectrometry assays for steroid hormones. J Steroid Biochem Mol Bio. 2010; 121(3-5): 491-495. doi: 10.1016/j.jsbmb.2010.05.001Stanczyk FZ, Clarke NJ. Advantages and challenges of mass spectrometry assays for steroid hormones. J Steroid Biochem Mol Bio. 2010; 121(3-5): 491-495. doi: 10.1016/j.jsbmb.2010.05.001Fanelli F, Gambineri A, Mezzullo M, Vicennati V, Pelusi C, Pasquali R, et al. Revisiting hyper- and hypo-androgenism by tandem mass spectrometry. Rev Endocr Metab Disord. 2013; 14(2): 185-205. doi: 10.1007/s11154-013-9243-yFanelli F, Gambineri A, Mezzullo M, Vicennati V, Pelusi C, Pasquali R, et al. Revisiting hyper- and hypo-androgenism by tandem mass spectrometry. Rev Endocr Metab Disord. 2013; 14(2): 185-205. doi: 10.1007/s11154-013-9243-yWierman ME, Auchus RJ, Haisenleder DJ, Hall JE, Handelsman D, Hankinson S, et al. Editorial: The new instructions to authors for the reporting of steroid hormone measurements. Mol Endocrinol. 2014; 28(12): 1917. doi: 10.1210/me.2014-1285Wierman ME, Auchus RJ, Haisenleder DJ, Hall JE, Handelsman D, Hankinson S, et al. Editorial: The new instructions to authors for the reporting of steroid hormone measurements. Mol Endocrinol. 2014; 28(12): 1917. doi: 10.1210/me.2014-1285Tosi F, Fiers T, Kaufman JM, Dall’Alda M, Moretta R, Giagulli VA, et al. Implications of androgen assay accuracy in the phenotyping of women with polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 2016; 101(2): 610-618. doi: 10.1210/jc.2015-2807Tosi F, Fiers T, Kaufman JM, Dall’Alda M, Moretta R, Giagulli VA, et al. Implications of androgen assay accuracy in the phenotyping of women with polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 2016; 101(2): 610-618. doi: 10.1210/jc.2015-2807Trabert B, Xu X, Falk RT, Guillemette C, Stanczyk FZ, McGlynn KA. Assay reproducibility of serum androgen measurements using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Steroid Biochem Mol Biol. 2016; 155(PtA): 56-62. doi: 10.1016/j.jsbmb.2015.09.032Trabert B, Xu X, Falk RT, Guillemette C, Stanczyk FZ, McGlynn KA. Assay reproducibility of serum androgen measurements using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Steroid Biochem Mol Biol. 2016; 155(PtA): 56-62. doi: 10.1016/j.jsbmb.2015.09.032Suturina L, Lizneva D, Danusevich I, Lazareva L, Belenkaya L, Nadeliaeva I, et al. The design, methodology, and recruitment rate for the Eastern Siberia PCOS epidemiology&phenotype (ES-PEP) Study. Abstracts of the 41st Annual Meeting of the Androgen Excess & PCOS Society. Lorne, Victoria, Australia; 2016: 76.Suturina L, Lizneva D, Danusevich I, Lazareva L, Belenkaya L, Nadeliaeva I, et al. The design, methodology, and recruitment rate for the Eastern Siberia PCOS epidemiology&phenotype (ES-PEP) Study. Abstracts of the 41st Annual Meeting of the Androgen Excess & PCOS Society. Lorne, Victoria, Australia; 2016: 76.Deshpande M, Kasture S, Mohan M, Chavan M. Bioanalytical method development and validation: A review. In: Muharrem L, Olcay Kaplan I (еds) Recent Advances in Analytical Chemistry. London: Intech Open; 2019.Deshpande M, Kasture S, Mohan M, Chavan M. Bioanalytical method development and validation: A review. In: Muharrem L, Olcay Kaplan I (еds) Recent Advances in Analytical Chemistry. London: Intech Open; 2019.Boterman M, Doig M, Breda M, Lowes S, Jersey J, Shoup R, et al. Recommendations on the interpretation of the new European Medicines Agency Guideline on Bioanalytical Method Validation by Global CRO Council for Bioanalysis (GCC). Bioanalysis. 2012; 4(6): 651-660. doi: 10.4155/bio.12.18Boterman M, Doig M, Breda M, Lowes S, Jersey J, Shoup R, et al. Recommendations on the interpretation of the new European Medicines Agency Guideline on Bioanalytical Method Validation by Global CRO Council for Bioanalysis (GCC). Bioanalysis. 2012; 4(6): 651-660. doi: 10.4155/bio.12.18Fiandalo MV, Wilton JH, Mantione KM, Wrzosek C, Attwood KM, Wu Y, et al. Serum-free complete medium, an alternative medium to mimic androgen deprivation in human prostate cancer cell line models. Prostate. 2018; 78(3): 213-221. doi: 10.1002/pros.23459Fiandalo MV, Wilton JH, Mantione KM, Wrzosek C, Attwood KM, Wu Y, et al. Serum-free complete medium, an alternative medium to mimic androgen deprivation in human prostate cancer cell line models. Prostate. 2018; 78(3): 213-221. doi: 10.1002/pros.23459Zhang J, Wu H, Kim E, El-Shourbagy TA. Salting-out assisted liquid/liquid extraction with acetonitrile: A new high through put sample preparation technique for good laboratory practice bioanalysis using liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 2019; 23(4): 419-425. doi: 10.1002/bmc.1135Zhang J, Wu H, Kim E, El-Shourbagy TA. Salting-out assisted liquid/liquid extraction with acetonitrile: A new high through put sample preparation technique for good laboratory practice bioanalysis using liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 2019; 23(4): 419-425. doi: 10.1002/bmc.1135Salameh WA, Redor-Goldman MM, Clarke NJ, Reitz RE, Caulfield MP. Validation of a total testosterone assay using highturbulence liquid chromatography tandem mass spectrometry: total and free testosterone reference ranges. Steroids. 2010; 75(2): 169-175. doi: 10.1016/j.steroids.2009.11.004Salameh WA, Redor-Goldman MM, Clarke NJ, Reitz RE, Caulfield MP. Validation of a total testosterone assay using highturbulence liquid chromatography tandem mass spectrometry: total and free testosterone reference ranges. Steroids. 2010; 75(2): 169-175. doi: 10.1016/j.steroids.2009.11.004Alvi SN, Hammami MM. An improved method for measurement of testosterone in human plasma and saliva by ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Adv Pharm Technol Res. 2020; 11(2): 64-68. doi: 10.4103/japtr.JAPTR_162_19Alvi SN, Hammami MM. An improved method for measurement of testosterone in human plasma and saliva by ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Adv Pharm Technol Res. 2020; 11(2): 64-68. doi: 10.4103/japtr.JAPTR_162_19van Nuland M, Venekamp N, Wouters WME, van Rossum HH, Rosing H, Beijnen JH. LC-MS/MS assay for the quantification of testosterone, dihydrotestosterone, androstenedione, cortisol and prednisone in plasma from castrated prostate cancer patients treated with abiraterone acetate or enzalutamide. J Pharm Biomed Anal. 2019; 170: 161-168. doi: 10.1016/j.jpba.2019.03.043van Nuland M, Venekamp N, Wouters WME, van Rossum HH, Rosing H, Beijnen JH. LC-MS/MS assay for the quantification of testosterone, dihydrotestosterone, androstenedione, cortisol and prednisone in plasma from castrated prostate cancer patients treated with abiraterone acetate or enzalutamide. J Pharm Biomed Anal. 2019; 170: 161-168. doi: 10.1016/j.jpba.2019.03.043

The authors declare that there are no conflicts of interest present.