младший научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций
664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия
Junior Research Officer at the Laboratory of Arthropod-Borne Infections
Timiryazev str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation
кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций
64003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия
Cand. Sc. (Biol.), Leading Research Officer at the Laboratory of Arthropod-Borne Infections
Timiryazev str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation
доктор биологических наук, руководитель лаборатории трансмиссивных инфекций
http://orcid.org/0000-0002-6705-3070
664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия
Dr. Sc. (Biol.), Head of the Laboratory of Arthropod-Borne Infections
Timiryazev str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation
Обоснование. Для изучения механизмов репликации вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в клетках позвоночных хозяев разных видов необходимо дифференциальное определение концентрации геномной и репликативной форм РНК (+РНК и –РНК соответственно). Однако имеющиеся в настоящее время подходы рассчитаны на измерение суммарного количества вирусной РНК. Для достоверного определения количества вирусной РНК на разных стадиях репликативного цикла требуется оптимизация методики ОТ-ПЦР.Цель исследования. Разработать панель стандартных образцов синтетической ВКЭ и оптимизировать ОТ-ПЦР для специфичного количественного определения геномной +РНК вируса.Методы. Фрагмент геномной +РНК ВКЭ синтезировали с использованием плазмидного вектора pTZ57RT\A со встроенным промотором T7 и соответствующей РНК-полимеразы. Контаминирующую ДНК удаляли с помощью обработки свободной от РНКаз ДНКазой I и дополнительного этапа выделения РНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием специфичного антисмыслового праймера 11154R 5`- AGCGGGTGTTTTTCCG-3`, а количественное определение с помощью ПЦР выполняли согласно M. Schwaiger и P. Cassinotti (2003) с модификациями.Результаты. В результате амплификации стандартных образцов концентрации РНК ВКЭ положительной полярности, проведённой в пяти независимых повторах в разные дни, коэффициент корреляции R2 между циклом количественного определения и концентрацией стандартного образца составил 0,99, а эффективность ПЦР составила 100%. Характеристики воспроизводимости, линейности и эффективности ПЦР свидетельствуют о валидности определения концентрации РНК ВКЭ. Коэффициент вариации при оценке межтестовой точности определения в среднем составил 2,8%, что сопоставимо с показателями оригинальнй методики.Заключение. Оптимизированная количественная ОТ-ПЦР позволяет проводить рутинное лабораторное определение количества геномной РНК ВКЭ.
Background. The specific detection of genomic/template +RNA and replicative –RNA of tick-born encephalitis virus (TBEV) is necessary to study the mechanisms of viral replication in the cells of reservoir and accidental hosts. However, the current approaches of quantitative reverse transcription – polymerase chain reaction (qRT-PCR) are rather focused on the detection of total viral RNA load in the sample. Thus, the significant optimization is necessary both for RT-PCR and for RNA copy number standard preparation.Aims. To develop the set of standard samples of synthetic +RNA of TBEV and to optimize qRT-PCR for quantification of genomic +RNA of the virus.Materials and methods. Fragment of the genomic +RNA of TBEV was synthesized using pTZ57R-T\A plasmid vector with embedded T7 promoter and T7 RNA polymerase. The DNA contamination was removed using RNase-free DNase I treatment followed by additional RNA purification step. Reverse transcription was performed using specific antisense primer 11154R 5`- AGCGGGTGTTTTTCCG-3` and qPCR detection was used according to the modified procedure of M. Schwaiger and P. Cassinotti (2003).Results. As a result of the amplification of standard samples, the concentration of positive polarity ТBEV RNA, carried out in five independent repetitions on different days, the correlation coefficient R2 between the quantification cycle and the concentration of the standard sample was 0.99, and the efficiency of PCR was 100 %. The coefficient of variation in assessing the inter-test accuracy of determination averaged 2.8 %.Conclusions. Optimized qRT-PCR procedure and set of +RNA standards allow to determine the concentration of genomic +RNA of TBEV in routine laboratory practice.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.