Целью данного исследования является определение эффективности сконструированных униплекс-, дуплекси мультиплекс-вариантов ПЦР тест-системы для эпизоотологического обследования природных очагов чумы, определение специфичности и чувствительности ПЦР наборов для выявления возбудителя чумы с атипичными признаками, для исследования переносчиков чумного микроба в природных очагах чумы. Исследование проводили на модели штаммов возбудителя чумы и близкородственных микробов, групповых суспензии блох и клещей. Подбор праймеров для детекции гена caf1, pla иyopE осуществлялся с помощью программного обеспечения Primer 3 и комплекса онлайн-программ BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool. Синтез праймеров осуществлялся традиционным фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК/РНК H6 (K&A, Германия). Очистка полученных растворов праймеров проводилась методом гель-фильтрации на колонках Centri-Pure N10 (emp Biotech GmbH, Германия). Экстракция геномной ДНК Y.pestis, Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica осуществлялась с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Германия). Тестирование специфичности праймеров и тест-систем проводилось методом стандартной ПЦР. Анализ результатов амплификации осуществлялся стандартным методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. В работе использовали штаммы Y.pestis из коллекции музея живых культур (МЖК) КНЦКЗИ, суспензии блох и клещей, собранных в Среднеазиатском пустынном очаге чумы. Впервые в Казахстане сконструированы для производственного изготовления ПЦР тест-системы для детекции чумного микроба в полевых и лабораторных условиях. ПЦР тест-системы на основе праймеров к генам чумного микроба yopE, cafl и pla позволили выявить циркуляцию F1-(бесфракционных) штаммов чумного микроба. Исследование групповых суспензий блох и клещей, собранных в период эпизоотологического обследования природных очагов чумы, подтвердило специфичность, высокую чувствительность наборов.
The aim of the research is to determine of the efficiency of developed uniplex, duplex, and multiplex variants of PCR test systems for the epizootic research of the plague natural foci. The research was carried out on the model of plague and its relative strains, and with the suspension of fleas and ticks. Selection of the primers used for detection of the genes cafl, pla and yopE is carried out by the program software Primer 3 and the complex of online program BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool. Synthesis of primers is carried out by the traditional phosphoramidite method on the automatic synthesizer DNA/RNA H6 (K&A, Germany). Purification of the received solutions of primers is carried out by the gel filtration method on Centri-Pure N10 columns (emp Biotech GmbH, Germany). Extraction of genomic DNA of Y. pestis, Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica is done by QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany). Testing of specific primers and test system was carried out by the standard PCR. Analysis of amplification's results is conducted by standard method of horizontal agarose gel electrophoresis. In the research, Y.pestis strains from the Alive cultures museum of M. Aikimbayev's Kazakh Scientific Center for Quarantine and Zoonotic Diseases, and suspensions of ticks and fleas collected from the Central Asian Desert Plague Focus were used. For the first time in Kazakhstan, for production, PCR test systems have been developed for detection of the plague microbe in the field and laboratory conditions. The PCR test systems developed on the base of specific primers to plague microbe's genes yopE, cafl and pla helped to detect the circulation of plague microbe without Fl (without fraction). Research of suspensions of fleas and ticks collected during the plague epizooty confirmed the specificity and high sensitivity of the developed test systems.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.